1.    技術簡介

實時熒光定量PCR(real-time quantitativePCR),是指在PCR反應體系中加入熒光染料SYBR或熒光標記的特異性探針，利用熒光信號的積累實時在線監控PCR反應過程，由于在PCR擴增基因的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據，可以實現對目的基因在樣本中的定量。

熒光定量PCR不僅實現真正實現了定量，而且具有靈敏度和特異性、高能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點。隨著生物芯片技術和熒光探針定量技術的結合，實時熒光定量PCR在醫學檢測及其他各個領域中的應用前景十分廣闊。

2.    方法介紹

根據Real-time qPCR所使用熒光化學物質有熒光染料和熒光探針兩類，根據使用熒光物質不同，該技術常用的方法有SYBR Green染料法和TaqMan探針法。

2.1   SYBR Green染料法

目前主要使用的熒光染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I是一種能與DNA雙鏈小溝的特異性結合染料。游離的SYBR Green I幾乎沒有熒光信號，而結合雙鏈DNA后，則會發射熒光信號。在熒光定量PCR擴增過程中，隨著PCR循環數的遞增，PCR產 物不斷積累，熒光信號也會相應的增加，其熒光信號強度代表雙鏈DNA分子的數量。SYBR Green I方法是一種最基礎也常用的Real-time qPCR實驗手段。

熒光染料的優點：使用簡便；可以與任何PCR產物結合；價格便宜

2.2 TaqMan探針法

Real-time qPCR中常用的熒光探針為TaqMan探針，根據目的基因設計合成特異性的探針，該探針的5'端標記熒光基團，3'端標記淬滅基團。

正常情況下兩個基團的空間距離很近，熒光基因因淬滅而不能發出熒光。PCR擴增時，引物與該探針同時結合到模板上，探針的結合位置位于上下游引物之間。當擴增延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5'外切酶活性，將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來，從而使其發出熒光。檢測到的熒光分子數與PCR產物的數量成正比，因此，根據PCR反應體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數量。

TaqMan探針技術的優點：

熒光背景低；

敏感性高；

穩定性高；

特異性高。

3.    操作方法

（1）根據目的基因序列分別設計特異性的引物或者熒光探針；

（2）提取各樣本DNA/RNA、RNA反轉錄、跑電泳、測濃度；

（3）去基因組DNA，RNA反轉錄；

（4）配置PCR反應體系，加入模板、引物、染料和dNTP等體系所需的溶液；

（5）      RealTime PCR(熒光定量PCR)擴增，

（6）拿到下機數據，進行擴增曲線、溶解曲線、表達量差異等分析。