從一個點光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上，如果物體恰在焦點上，那么反射光通過原透鏡應當匯聚回到光源，這就是所謂的共聚焦，簡稱共焦。其意義是：通過移動透鏡系統(tǒng)可以對一個半透明的物體進行三維掃描。共聚焦顯微鏡能提供無比準確的三維成像，以及對亞細胞結(jié)構(gòu)和動力學過程的準確測試。
共焦顯微鏡在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡，將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向，在其焦點上有一個帶有針孔的擋板，小孔就位于焦點處，擋板后面是一個光電倍增管。可以想像，探測光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng)，必不能聚焦到小孔上，會被擋板擋住。于是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。
傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共聚焦顯微鏡利用激光束經(jīng)照明針孔形成點光源對標本內(nèi)焦平面的每一點掃描，標本上的被照射點，在探測針孔處成像，由探測針孔后的光電倍增管（PMT）或冷電耦器件（cCCD）逐點或逐線接收，迅速在計算機監(jiān)視器屏幕上形成熒光圖像。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點不會在探測針孔處成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學橫斷面，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點。
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