白細胞介素10（IL-10）ELISA試劑盒

                               使用說明書

本試劑僅供研究使用                
目的：本試劑盒用于測定人血清，血漿及相關(guān)

液體樣本中白細胞介素10（IL-10）含量。

實驗原理：

     本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人白細胞介素10 （IL-10）水平。用純化的人白 細胞介素10 抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入白細胞介素10， 再與HRP  標記的羊抗豬抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-10 呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），

通過標準曲線計算樣品中人白細胞介素10  （IL-10）濃度。

簡介：

人和小鼠IL-10 基因都定位于第1 號染色體，其基因組包括5 個外顯子和4 個內(nèi)含子，并可

能有NF- κB 和AP-1  的結(jié)合位置。人和小鼠IL-10 在DNA 和氨基酸水平上分別有81%和

73%的同源性。DNA  序列分析表明，IL-10  與EB 病毒基因組中開放讀框區(qū)Ⅰ（BCRF- Ⅰ）有

70%左右的同源性。有人把BCRF- Ⅰ的基因產(chǎn)物稱為病毒IL-10                     （vIL-10 ），提示EBV 可能

攝取了哺乳動物IL-10  的基因，以求自身的生存。IL-10  的拮抗劑可能具有抗EB 病毒的

作；而IL-10 通過促進單核細胞表達IL-1ra 而可能成為抗炎癥的治療手段，動物實

驗表明，IL-10 可有效地避免LPS 誘導小鼠休克而造成的死亡。

試劑盒組成：

試劑盒組成                 48 孔配置            96 孔配置              說明

酶標包被板                    1×48                 1×96          2-8℃保存

封板膜                   2 塊（48 ）              2 塊（96）

標準品：360μg /L          1 瓶×0.5ml             1 瓶×0.5ml       2-8℃保存

標準品稀釋液                1 瓶×1.5ml             1 瓶×1.5ml       2-8℃保存

酶標試劑                   1 瓶×3 ml             1 瓶×6 ml        2-8℃保存

樣品稀釋液                  1 瓶×3 ml             1 瓶×6 ml        2-8℃保存

顯色劑A 液                 1 瓶×3 ml             1 瓶×6 ml        2-8℃保存

顯色劑B 液                 1 瓶×3 ml             1 瓶×6 ml        2-8℃保存

20 倍濃縮洗滌液             1 瓶×30ml              1 瓶×50ml        2-8℃保存

終止液                    1 瓶×3ml              1 瓶×6 ml        2-8℃保存

說明書                      1 份                   1 份

樣本處理及要求：

1，血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集

   上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。
2，血漿：應根據(jù)標本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20 分鐘

   后，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，

   應該再次離心。

3，尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程

    中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4，細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)

   /分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS                     （PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞

   濃度達到100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20 分

   鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5，組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存

   備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS                        （PH7.4），用手工或勻漿

   器將標本勻漿充分。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份

   待檢測，其余冷凍備用。

操作步驟

1.  1、標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10 孔，在*、第二孔中分別加

    標準品100μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第

    二孔中各取 100μl     分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液

    50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl 棄掉，再各取50μl 分別加到第五、

    第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六

    孔中各取50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，

    混勻后從第七、第八孔中分別取50μl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標

    準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，

    濃度分別為240μg /L，160μg /L     ，80μg /L，40μg /L，20μg /L）。

2.    加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測

    樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl

     （樣品zui終稀釋度為5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃

    動混勻。

3.  溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。

4.  配液：將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用。

5.  洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此

    重復5 次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7.  溫育：操作同3。

8.  洗滌：操作同5。

9.  顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

    15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止

    液后15 分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未

   用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。

3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4．請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD 值

   大于標準品孔*孔的OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計

   算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物請避光保存。

7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9．本試劑不同批號組分不得混用。

10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

    以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，

    在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD

    值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋

    倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD 值計算出標

    準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 值

    代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

    倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

  試劑盒性能：

  1.樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為0.990 以上。

  2.批內(nèi)與批見應分別小于9%和11%

  檢測范圍：                                                   保存條件及有效期

10μg/L -360μg/L                                         1．試劑盒保存：；2-8℃。

                                                         2．有效期：6 個月

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