ELISPOT 技術簡介

　　隨著酶聯免疫分析技術在醫學及生物學領域的廣泛應用 , 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應答機制時以往常用用酶聯免疫吸附法（ ELISA ）檢測體液中游離的細胞因子（ CK ）或抗體，但由于游離的循環抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結合，而不能確切的反映體內的抗體及 CK 的水平。 80 年代，國外的科研工作者根據 ELISA 技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯免疫斑點技術（ ELISPOT ）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內外廣泛應用，對探索自身免疫系統疾病發病機制具有重要意義。

　　ELISPOT 法源自 ELISA ，又突破傳統 ELISA 法，是定量 ELISA 技術的延伸和新的發展。兩者都是檢測細胞產生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

n         ELISA 通過顯色反應，在酶標儀上測定吸光度，與標準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

n         ELISPOT 也是通過顯色反應，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應位置上顯現清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統對斑點進行計數， 1 個斑點代表 1 個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）

n         由于是單細胞水平檢測， ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。

n         捕獲抗體為高親和力、高特異性、低內毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

　　ELISPOT全名為Enzyme-linked Immunospot Assay，其技術原理與ELISA相似。其實驗設計是在96微孔培養盤底部披覆PVDF薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性（不含sodium azide、內毒素endotoxin）的單株抗體。靜脈血PBMC細胞經適當分離處理后，會被分配到微孔盤上，再接受適當的抗原刺激，并將微孔盤放置于溫箱中過夜培養一段時間。一般而言，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時后會開始分泌細胞激素，此時局部（在緊靠分泌細胞的周圍）分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除并清洗后，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素（Biotin）標記的二次抗體來標志，其后再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，并加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點。

ELISPOT 檢測原理 

　　細胞受到刺激后局部產生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后， 被捕獲的細胞因子與生物素標記的二抗結合，其后再與堿性磷酸酶標記的親和素結合。 BCIP/NBT 底物孵育后， PVDF 孔板出現“紫色”的斑點表明細胞產生了細胞因子，通過 CTL 公司生產的 ELISPOT 酶聯斑點分析系統對斑點的分析后得出結果。

ELISPOT 分析儀的出現解決了以下問題 

n         哪些斑點是抗原特異性 T 細胞產生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關細胞產生的（此斑點沒有 T 細胞研究價值）

n         斑點大小的意義

n         在對不同細胞因子計數和分析時，如何定義斑點zui大和zui小尺寸

n         如何從單個細胞基礎上分析

n         實驗度有多高？如果一個細胞產生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結果？

n         幾次重復實驗才能使結果更有意義？

ELISPOT 斑點的判讀

　　像多數的Cell-based分析技術一樣，ELISPOT Cytokine技術也是相當耗時、耗勞力的工作。事實上到目前為止，以目視法判讀少量細胞族群的特性如激活T細胞之激素分泌，仍被視為是免疫學技術上的一大挑戰。ELISPOT結果的判讀常需要專聘、有經驗的技術員才可以；有時就算有專職技師判讀，使用傳統的顯微鏡計算斑點數仍不免會偶有主觀意見，而有所偏頗。

　　科學實證的本質，在于如何使實驗結果能盡可能客觀、、同時有高重現性，傳統的人工計算法顯然無法達到此一要求。故而有幾個科研團隊使自行開發Plate Scanner與自動分析軟件，其中以Paul Lehmann教授研究開發之ImmunoSpot? Analyzer自動分析儀代表性。分析ELISPOT實驗數據的過程中，儀器先以高分辨率鏡頭捕捉微小孔中膜上呈色影像，而后儲存成TIF檔；這些影像可以進一步使用手動、或是自動方式計算斑點數目，如果使用ImmuneSpot分析軟件，可以先設定條件，然后同時分析斑點的大小，以推估激素分泌的多寡。預料像ImmunoSpot? Analyzer這一類自動圖像掃描分析儀器，將可克服傳統顯微鏡判讀方法耗費人力、及人為客觀性等缺點，*解除ELISPOT分析技術的瓶頸問題，進一步推廣該技術的新穎應用。

　　ImmunoSpot@影像掃描分析儀可以提供不同的數據格式，包括未處理與處理過的膜表面影像、每個小孔中的斑點數目、每個小孔中的平均斑點數目、每個小孔中斑點大小的直方統計圖。

ELISPOT技術的過去

　　ELISPOT是20多年前便己研發成功的老技術。Czerkinsky 等人在1983年，運用該技術成功地檢測出因受激而分泌抗體的B細胞頻率。從那時起世界各國免疫學者便開始一長期的ELISPOT Cytokine技術競賽，每個團隊都希望能將此一技術推廣來研究T細胞免疫，其絕妙之處在提供一接近體內實驗的環境，藉由偵測T細胞分泌的各類細胞因子，來定量機體內免疫反應啟始者Precursor T的clonal size族群大小，同時預測體內免疫系統即將進行的下游免疫反應。

　　ELISPOT Cytokine技術雖說操作簡單，但該技術并沒能如預期地很快地被成功應用在ex vivo T細胞功能研究。要讓ELISPOT技術從B細胞免疫走向T細胞免疫的產生的*個主要問題，便是靈敏度的提升，因為T細胞因子較之B細胞免疫球蛋白產量極少。早期ELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質、呈色底膜的材質等幾個技術性的問題，使當時多數研究團隊很難獲得清晰的斑點，結果是敏感度不夠、數據分析重現性低。這問題直到1996美國俄亥俄卅Case Western Reserve大學Paul Lehmann團隊引進PVDF薄膜的應用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解決了該技術因斑點呈色問題造成低敏感度的缺失。與原來的標準膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使T細胞分泌的各類細胞因子能在細胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清晰、對比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。圖一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）與傳統標準薄膜（Panel B）并行實驗的比較結果。同樣的人體 PBMC樣品，在通過*相同的實驗，Panel A呈現較清晰的小色點。

　　第二個技術性問題是ELISPOT Cytokine實驗分析的幾個基本假設缺乏科學實證，也使得該技術在當時并沒受到該有的廣泛重視。沒有科研人員嘗試去厘清一些基礎但很重要的問題，諸如； 　　

n         實驗所得的斑點是抗原特定T細胞所生產，還是旁觀細胞受Cytokine刺激的次級效應？

n         斑點的小或大有何生理意義；如何決定cutoff值？

n         能否相信斑點是由單一的細胞造成？

n         ELISPOT Cytokine分析技術能準確測量的頻率范圍？

n         如果效應相互拮抗的cytokine同時產生，它們是否會互相妨礙？及到什么程度？

ELISPOT 技術的現在

　　1996年以來隨著抗體制備、PVDF膜材篁等技術改良，ELISPOT 分析技術已經逐漸達到科研人員的期待，它已是當世*zui靈敏抗原特定T細胞的體外檢測技術。藉由檢驗新鮮分離PBMC細胞所分泌cytokine的指紋，ELISPOT 分析技術可提示T細胞免疫系統的兩個重要參數：抗原特定T細胞的clone族群大小；和免疫效應細胞的信號傳導路徑Th1/Th2。

　　多年來經過數十個研究團隊的致力研究，對于ELISPOT分析技術本身的幾個問題，也有了科學上的驗證。目前一般*，ELISPOT技術允許科研人員在單細胞水平上識別抗原特定T細胞，主要針對經由CD4或者CD8細胞的免疫反應。在適當的實驗設計下，ELISPOT Cytokine 斑點的數量分析顯示斑點是由一個單細胞所生成，同時斑點形態學與Time Response分析則顯示斑點直徑大小直接反映該細胞族群的產能。也因為如此，ELISPOT是個免疫學上的標竿技術，它可以允許科研人員在幾乎自然生理條件下，觀察細胞實際分泌Cytokine的進程，進而可以得到藥理學信息，闡明免疫調節藥物如何影響T細胞分泌各類cytokine的速率。藥物抑制T細胞免疫一般可通過兩程截然不同的機轉；使能分泌Cytokine的Precursor T細胞族群變小，或減少每Precursor T細胞的cytokine產能，而ELISPOT技術能提供雙份信息。

　　ELISPOT分析技術的幾個特點已經讓它在抗原特定T細胞免疫學上*。此技術是當世*準許百萬分之一1:1000,000的準確分析，如此強效的解析力使流式細胞技術也望其項背，以目前國內外常規的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技術的靈敏度一般限制在1:10,000。這樣的高靈敏度對T細胞免疫學研究是必須的，因為抗原特定T細胞一般在機體周邊循環系統發生的頻率通常低于萬中取一。此外由于ELISPOT Cytokine技術被證實適用于冰凍后復蘇的人類淋巴球，解凍后PMBC與新鮮分離樣品有相當的效價，沒有喪失功能。這一點對臨床試驗非常重要，它使科研人員得以并行分析免疫治療前、后的病人血樣，如果試驗牽涉全國多個臨床試驗機構，病人血樣可冰存并同時集中在「*實驗室」一齊被測試。同理，一個血樣或標準對照品可被分裝小份，被送到不同檢驗中心進行測試，以交互比對，同時有利LISPOT Cytokine技術流程的規范化、標準化。

ELISPOT 未來展望

　　據筆者的觀察，ELISPOT 分析技術正在歐美各國發揮它的完整潛能，它讓免疫學家可以直接洞察活體內T細胞相關生理學或病理學，就像是心臟外科醫師手上的那張心電圖，經由這個技術科研人員可以在活體內直接進入一個器官系統，在那里視察、發掘，得到全新的智識。

　　從各國文獻可見ELISPOT技術已經達到標準化、規范化的要求，并被廣泛地應用在多項領域，包括監視癌癥病人接受免疫療程時的反應（Lewis, 2000 and Janetzki, 2000），以及感染性疾病（Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000）、腫瘤（Nagorsen, 2000）、或自體免疫病人體內的一個特定的免疫反應型式（Pelfrey, 2000）。ELISPOT技術同時也在數個疫苗效價評估人體試驗中，被當成重要的終結指針。2003年1月，世界衛生組織通過與大陸北京性艾中心合作，將應用ELISPOT技術來監測HIV疫苗研究免疫應答反應技術，該計劃將是利用ELISPOT技術對亞洲國家從事HIV疫苗研究和臨床試驗的有關研究。我們期待未來此一技術能在我國免疫學界得到廣泛地應用。

其它ELISPOT應用范圍

n         移植研究 – allograft rejection

n         疫苗開發 -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響

n         Th0/Th1/Th2細胞轉換分析

n         自體免疫研究 – 免疫調節及免疫治療研究

n         癌癥研究 -腫瘤反應T細胞作用

n         過敏機制探討 – IL-4誘導免疫球蛋白亞型轉換，其它參與過敏機制之細胞激素研究

n         傳染疾病研究 – Lyme disease, Chlamydia infections, Helicobacter pylori infections, HIV infections, multiple sclerosis, …等

n         抗原決定位定圖

n         體液免疫力研究 – B細胞免疫球蛋白及特定亞型反應的進展研究

目前 CTL 公司使用 ImmunoSpot 的部分研究領域如下

n         單細胞解析度/體外抗原特異性 T 細胞頻率的準確測量

n         測量 1 類和 2 類免疫力

n         T 細胞的同源性細胞因子產物與旁細胞因子產物

n         功能性 T 細胞親和力的測量

n         細胞因子協同表達 / 雙色 ELISPOT

n         斑點尺寸分布

n         PBMC的體外測量的分析到分析的重可生產性

n         新鮮和低溫儲藏后的人類PBMC的比較

n         CD 8+ T 細胞和CD8+ T 細胞和 Granzyme B 的 ELISPOT 分析

n         除了人類 PBMC 、鼠淋巴結/脾臟細胞以外的細胞的 ELISPOT 分析

n         免疫與佐藥

n         腫瘤免疫

n         移植免疫

ELISPOT 技術優勢 

ELISPOT 分析使單細胞分泌產物可視化。這些分析異常敏感，因為它是在直接在分泌細胞的周圍進行捕捉，而且是在表面被沖淡，或者被臨近的細胞上的受體捕獲，或降解之前。

zui低至1：100萬細胞精度的活體外頻率測量。這種分辨率已經遠遠超過使用細胞內細胞因子的四聚物染色和 ELISA 法測量的精度。這種高敏感度是非常關鍵的，因為抗原特異性 T 細胞在體外都是典型性的低頻率。

高產量 T 細胞分析成為可行。一個經過訓練的相關實驗室小組可以測試成百的樣本中幾十種抗原的反應。

只需要少量細胞，就可以用于通其他細胞學分析方法進行比較。例如，45毫升的血液就足以用于測試600種不同抗原/肽類物質的反應。

可以定義CD4和CD8細胞的免疫因子指標。這是因為只需要少數細胞，分析就可以在高產量模式下進行。ELISPOT 分析在篩選肽庫，繪制免疫因子方面是一個理想的工具。

用于確定抗原特異性 T 細胞的功能性親和力。這zui大可能受到肽類藥物刺激至50%的影響。

可以用于研究未經藥物處理過的細胞的分泌過程。如果觀察到凈產量減少，可以確定這種區別是來自于分泌細胞的減少，還是每個細胞分泌產量的減少。

淋巴細胞在 ELISPOT 分析后依然存活。這使得分析之后進行增值，用于更進一步的分析、克隆或者低溫儲藏成為可能。

低溫儲藏后的人類淋巴細胞可以用于檢測，而不會丟失其功能。治療前和治療后的樣本可以并排進行測試，結果可以重復。

選擇 CTL 的原因

　　我們是 ELISPOT 技術的世界

　　我們了當代細胞因子 ELISPOT 協議

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　　我們制造了*臺商業 ELISPOT 分析儀

　　我們將細胞因子 ELISPOT 分析提升到了科學

　　我們是 NIH 免疫耐受網 ELISPOT 分析的實驗室

　　我們是 BD 公司* ELISPOT 分析儀

　　我們專注于 ELISPOT 技術并極大拓展了其應用領域

　　我們是*能提供整體 ELISPOT 方案的技術提供商

　　    基礎研究

　　    臨床免疫監控

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　　    全套符合 GLP 規范的 ELISPOT 實驗室建設服務

　　    全面技術咨詢服務

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　　我們是*能提供全套 ELISPOT 質量控制的服務商

　　過去 15 年中，我們專注于 ELISPOT 研究，取得了巨大的成功。今后我們將一如既往地與客戶一起，全力推動 ELISPOT 的技術發展和進步。我們不僅提供 ELISPOT 全套技術解決方案，更看重并全力協助客戶掌握 ELISPOT 實驗技術。

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