蛋白（及酶）—小分子半抗原結(jié)合物的制備

    在臨床實(shí)驗(yàn)室中，我們常常會遇到有關(guān)小分子物質(zhì)如激素、治療藥物和毒品等的測定問題，而這些小分子通常分子量小于1 000，只是半抗原，僅有反應(yīng)原性，沒有免疫原性，如像蛋白大分子一樣，將其直接免疫動物，不能得到小分子的抗體，只有將其先與載體蛋白相連接，組成*抗原免疫動物，才能得到特異的抗小分子抗體，然后才能建立相應(yīng)的小分子的酶免疫測定方法。此外，由于小分子上抗原決定簇有限及空間位阻的原因，其在與特異抗體的結(jié)合時(shí)，一個(gè)小分子只能與一個(gè)抗體分子結(jié)合，因此，如使用ELISA方法測定小分子，通常只能應(yīng)用競爭抑制模式，這就需要制備酶—小分子結(jié)合物。因此，要建立小分子物質(zhì)的免疫測定方法，必須有一個(gè)制備蛋白—小分子半抗原結(jié)合物的過程。

    一、小分子的特性及蛋白載體的選擇

（一）小分子上與蛋白連接基團(tuán)的選擇對所產(chǎn)生抗體的特異性的影響小分子為具有多種反應(yīng)基團(tuán)如氨基、羧基、醛基等的物質(zhì)，這些基團(tuán)既是其區(qū)別于與其相近似分子的特異性抗原決定簇之所在，也是其用于與蛋白分子的交聯(lián)的結(jié)合基團(tuán)。因此，當(dāng)這些基團(tuán)與蛋白大分子結(jié)合后，再免疫動物所得到的抗體，往往特異性會有所降低，尤其是分子結(jié)構(gòu)上相近似的小分子，如選用每種小分子物質(zhì)*基團(tuán)連接蛋白，則免疫動物后所得抗體的特異性就差，因?yàn)槠涮禺惖目乖瓫Q定簇在刺激動物機(jī)體抗體的生成中不起作用，而共同的基團(tuán)所組成的抗原決定簇卻不受影響，激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生能結(jié)合具有此決定簇的所有近似小分子的抗體。因此，選擇相關(guān)小分子均有基團(tuán)用于與蛋白分子的交聯(lián)，得到的抗體具有較好的特異性。此外，在小分子與載體蛋白之間加入一連接空間臂，也能改善所得抗體的特異性。

    （二）小分子與載體蛋白的分子比對抗體產(chǎn)生的影響

    對于免疫動物產(chǎn)生抗體來說，并不是載體蛋白上小分子越多越好，而是一定數(shù)量的小分子對免疫動物產(chǎn)生抗體來說是的，如使用牛血清白蛋白（BSA）作為載體蛋白，每分子結(jié)合8～25個(gè)小分子較為合適。

    （三）載體蛋白的選擇

    選擇適當(dāng)?shù)妮d體蛋白對于有效地免疫動物得到抗小分子抗體非常關(guān)鍵。zui常用的載體蛋白是與擬使用免疫動物不同種屬的動物血清白蛋白、戚鑰血藍(lán)蛋白（keyholelimpet hemocya—nin）、卵清蛋白及纖維蛋白原等。載體蛋白一般以其反應(yīng)活性的基團(tuán)如s—和。—氨基（pKa分別為10和8）、酚基、巰基（pKa為9）、咪唑（pKa為7）和羧基（pKa2～4）等，所謂的pKa為基團(tuán)的一半處于質(zhì)子化時(shí)的pH值。因此，pH值的變化會引起這些基團(tuán)反應(yīng)活性的改變，親核基團(tuán)的非質(zhì)子化形式具有反應(yīng)性。

    二、用于小分子與蛋白交聯(lián)試劑的選擇

用于小分子與蛋白交聯(lián)的試劑可分為四大類，即①乙?；噭?；②烷基化試劑；③氧化還原試劑；④親電子試劑。乙酰化試劑的通用公式為R-C（＝O）—X，源于羧基（—COOH）的活化，如醋酸酐或混合酸酐、N—羥琥珀酰亞胺酯（NHS）和S—乙酰琉基琥珀酸酐等。由于所涉及基團(tuán)的pKa，在堿性條件下，乙?；噭┲饕c蛋白的氨基（去質(zhì)子的賴氨酸）和酪氨酸殘基形成穩(wěn)定，的衍生物，與半胱氨酸或組氨酸殘基形成不穩(wěn)定的衍生物。修飾的酪氨酸殘基可用羥胺處理而再生。一般情況下，酸酐會迅速水解，因此，其乙?；饔门c試劑的水解之間處于競爭之中。烷基化試劑中重要的是馬來酰胺，交聯(lián)反應(yīng)在較為溫和的堿性條件下（pH 7．0～8．5）進(jìn)行。烷基化試劑的質(zhì)子型是N—乙酰馬來酰胺和芳香基鹵化物，如DNFB或TDIC。氧化還原試劑如二硫化物很少用于交聯(lián)反應(yīng)。親電子試劑中zui常用的是重氮鹽。

    交聯(lián)試劑也可按其在小分子與載體蛋白之間形成橋接的本質(zhì)分類：①活化羧基（大多在小分子上）使其能與氨基反應(yīng)的試劑，這是使用的交聯(lián)試劑；②能在兩個(gè)氨基之間形成橋接的試劑；③與酪氨酸或組氨酸殘基連接產(chǎn)生偶氮基的試劑。

    與蛋白之間交聯(lián)一樣，用于小分子和蛋白間交聯(lián)的試劑的濃度亦應(yīng)較高，從而增加交聯(lián)物形成的可能性。可溶性相對差的試劑可置于5％～25％有機(jī)溶劑中。但不管使用何種交聯(lián)方法，都要盡可能避免載體蛋白本身的交聯(lián)，例如使用兩步交聯(lián)方法。如果小分子的羧基或氨基不是其特異性所必需的，則其可直接用于與蛋白的交聯(lián)，否則就需要在小分子上衍生此類基團(tuán)。

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