葡萄球菌A蛋白（SPA）各種免疫檢測試劑的制備

    SPA試劑的種類很多，主要有SPA菌體，包括熒光菌體和各種抗體標記的菌體；SPA純品標記的熒光素、同位素和酶標記試劑；用于親和層析的SPA-Sepharose CL-4B、6MB和SPA—agarose，以及用于免疫電鏡觀察的SPA-鐵蛋白、膠體金和SPA標記的血藍蛋白等。下面分別介紹幾種常用的SPA標記試劑的制備方法。

    （一）SPA純品的制備

    目前市場上已有SPA純品出售（美國Sigma、國內上海生物制品研究所均有SPA純品出售），本書僅作了解性介紹。SPA純品系由含A蛋白的Cowan I株金黃色葡萄球菌中純化獲得。其制備過程除細菌培養外，主要有提取和純化這兩個工藝組成。提取方法多種，其中溶葡萄球菌素與親和色譜組合方法zui有效。現介紹如下。

    （1）用0．05mol／L（pH 7．5）的Tris—HCl洗下菌苔，每100g濕菌加溶葡萄球菌素5mg，調節pH值到3．5，離心后取上清，并將pH值調到7．0。

    （2）用飽和硫酸銨沉淀，溶解透析，透析物用DEAE-SephadexA50純化，以0．1mol／L碳酸氫銨（NH4HC03）平衡后上樣，再平衡過夜。

    （3）用0．4mol／LNH‘HCOa洗脫（流速1．5ml／min），樣品測定AzTsam和活性，將含活性者合并、濃縮、凍干保存于一40~C中。

    （4）上述純化獲得的SPA可進一步用IgG-Sepharose 4B親和層析柱過濾，進一步純化SPA。

    （5）純度鑒定  用7．5％聚丙烯酰胺凝膠為分離系統進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，樣品濃度為lmg／m1，加樣量為40／／l。電泳結果應顯示一條明顯條帶。

    （二）熒光A蛋白純品的制備

    熒光A蛋白純品是在弱堿性條件下，由熒光素通過蛋白上的氨基共價包繞于A蛋白純品制成。其制備如下。

    （1）取一定量的A蛋白純品，用內含0．05mol／L NaCl的0．1mol／L氧化鈉溶液調節pH值到9．0。

    （2）于23~C暗處條件下，按lmol的A蛋白中加入2．8mol的FITC，攪拌60min，隨時用含0．15mol／L氯化鈉的0．1mol／L氫氧化鈉使pH值維持在9．0～9．5之間。

    （3）然后將標記SPA用平衡鹽溶液于4℃透析數次，過SephadexG-25柱，除去未標記的FITC，并調節濃度到lmg／ml，裝入棕色瓶，并保存于一20~C冰箱中。

    （三）酶標記A蛋白純品的制備

    HRP可以于共價鍵或非共價鍵方式黏附在其他的蛋白質分子上，常見的標記方法有戊二醛一步法和二步法，也可以用過碘酸鈉氧化法，它們主要為共價鍵結合方式；另一種為非共價鍵結合方式，是用4，4’—二氟—3，3，—二硝基苯基砜（4，4／—difluoro-3，3，—initrophenyl sul—lone，FNPS）作為交聯試劑。戊二醛二步法的標記效率要高于一步法，過碘酸鈉氧化法的標記效率要高于戊二醛二步法。其主要原理是二種蛋白質分子的賴氨酸上的基團和含氨基的N端經活化劑活化而結合。由于抗體和酶分子上所具有的反應基團很少，需通過功能基團（如戊二醛）將更多的抗體和酶分子結合在一起，酶分子首先和雙功能試劑結合，再與抗體分子結合，這樣可以結合更多的酶和抗體，而且無聚合物產生。HRP還可以與生物素和親和素結合。操作步驟如下。

    （1）取HRP 5mg，溶于0．1ml新鮮配制的0．3mol／L（pH3．1） NaHC03中，加0．1ml1％二硝基氟苯—無水乙醇，于室溫中避光輕輕攪拌1h。

    （2）再加入0．08mol／LNalOa lml，室溫中攪拌30min。

    （3）再加0．08mol／L乙二醇lml，混勻后輕輕攪拌1h。

    （4）裝入透析袋中，在4℃條件下，用0．01mol／L（pH9．5）

    （4）裝入透析袋中，在4℃條件下，用0．01mol／L（pH9．5）碳酸鹽緩沖溶液1500ml于2000ml燒杯中透析。

    （5）稱取純晶SPA 5mg，加入上述經醛化的HRP中，在25℃下充分混勻，輕輕攪拌5h。

    （6）加5mgNaBH4，置于4℃3h。

    （7）結合物用0．02mol／L，（pH7．4）PBS4℃透析3～4次，加等量甘油，-40℃或凍干避光保存。

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