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一文讀懂百時美施貴寶細胞趨化檢測模型
趨化是細胞響應化學刺激而產生的定向運動，它在免疫細胞招募、創口愈合以及癌癥轉移等生理病理活動中起著重要的作用。因此，調控趨化的相關分子成為藥物研發中的重要靶點。然而，傳統的趨化作用檢測方法往往受限于通量。Boyden是一種常用的細胞趨化研究工具，它由半透膜隔離形成兩個小室，細胞接種在上室，趨化因子加入下室，通過對遷移到半透膜下表面的細胞成像計數，可以定量趨化作用。
賽多利斯Incucyte® 實時活細胞分析系統配備了專門的趨化分析模塊，能夠在細胞培養箱中以96孔板的形式，實時可視化和自動定量分析細胞的趨化。
2018年百時美施貴寶（BMS）公司發表的一篇文章中就介紹了Incucyte® 對貼壁和懸浮細胞進行趨化檢測方案。接下來，就讓我們一起來看看這個方案吧~
實驗方法
圖1. Incucyte® 檢測用到的ClearView板（Sartorius，貨號 4582）由三部分組成：板蓋、小室和下室
在實驗開始前，根據實驗需求對小室的上下表面進行包被。在上室中接種細胞并加入處理因素，在下室中加入趨化因子。將上下室組合后放入Incucyte® 系統中，并對小室的上下表面進行連續成像。如上室接種的是懸浮細胞，其穿過8μm的半透膜直接進入下室，則上室檢測到的細胞會逐漸減少。如上室接種的是貼壁細胞，其穿過半透膜后會黏附在小室的下表面，則下表面檢測到的細胞隨時間會增加。
圖2. Incucyte® 趨化檢測的流程示意圖
研究結果
單核細胞THP-1的趨化
CCR1是一種G 蛋白偶聯受體（GPCR），表達于單核細胞、巨噬細胞、DCs、破骨細胞、T 淋巴細胞和中性粒細胞。CCR1能與MIP-1α,RANTES 和leukotactin-1等趨化因子結合后誘導免疫細胞的活化和遷移，因此BMS將其作為類風濕性關節炎（RA）的靶點，通過MIP-1α誘導的THP-1趨化實驗篩選CCR1的抑制劑。
圖3A展示了不同濃度的MIP-1α加入下室作用16h后誘導遷移的THP-1細胞的數量，結果呈現倒U型模式，其擬合的EC50值為0.2nM（相較于傳統Boyden小室測得的EC50為0.1nM）。圖3B采用1nM MIP-1α作為趨化因子，同時加入不同濃度的CCR1拮抗劑——化合物6，在較高濃度的化合物6條件下，小室上表面未遷移的THP-1細胞更多，說明化合物6抑制THP-1細胞的趨化。圖3C比較了6個CCR1拮抗劑用Incucyte® 與傳統Boyden小室趨化檢測結果，顯示出良好的一致性。
圖3. CCR1拮抗劑對MIP-1α誘導的THP-1細胞趨化的影響
樹突狀細胞（DC）的趨化
樹突狀細胞（DC）可以攝取和處理抗原、并轉移至淋巴結將處理后的抗原遞呈給初始T細胞，是最有效的抗原呈遞細胞（Antigen-presenting cells, APC）。研究表明iDC（未成熟細胞）表達CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4，而mDC（成熟細胞）則表達CCR7和CXCR4。
CCR1配體MIP-1α和CCR2配體MCP-1可以特異性誘導iDC細胞趨化，并且顯示出明顯的劑量依賴性（EC50分別為0.16nM和5.6nM，圖4A和B），而對mDC無作用。CCR1抑制劑——化合物1特異性抑制MIP-1α（4nM）誘導的iDC趨化，CCR2抑制劑——化合物7特異性抑制MCP-1（20nM）誘導的iDC趨化（兩者的IC50為1.3nM和1.1nM，圖4C和D，對應傳統Boyden小室檢測結果是1.9nM和1.7nM）。
CXCR4的配體SDF-1α特異性誘導mDC細胞趨化（EC50為13nM，圖4E），CXCR4特異性拮抗劑AMD3100的IC50為21nM(圖4F).
圖4. DC細胞趨化檢測
實體腫瘤細胞的趨化
乳腺癌是一種高轉移性的常見癌癥，在正常乳腺組織中，CXCR4的表達較低；然而在原發乳腺腫瘤和轉移性乳腺癌里，CXCR4表達顯著增高，且與患者預后差相關。研究表明，CXCR4配體SDF-1α確實特異性誘導乳腺癌細胞MDA-MB-231的趨化（EC50為22nM，圖5A），CXCR4拮抗劑AMD3100抑制MDA-MB-231細胞的趨化（IC50為82nM，圖5B）。
圖5. MDA-MB-231細胞趨化檢測
T細胞的趨化
作為細胞免疫的重要組成部分，文章還研究了CXCR4配體SDF-1α對活化的T淋巴細胞和調節性T細胞Treg的趨化作用，對應的EC50分別為33nM和22nM（圖6A和6C），CXCR4抑制劑AMD3100可以抑制兩種細胞的趨化，對應的IC50為99nM和89nM（圖6B和6D）。
圖6. SDF-1α/CXCR4介導的 T 細胞趨化檢測
Incucyte® 趨化檢測的重復性
以SDF-1α介導的人急性T淋巴細胞CCRF-CEM趨化為例，分別用Incucyte® 與傳統Boyden小室方法定量檢測10種CXCR4抑制劑對CCRF-CEM趨化的影響，將兩種方法測得的IC50進行相關性分析，其相關系數R2為 0.8（圖 7B）。在不同日期利用Incucyte® 進行兩次獨立的趨化測定，其相關系數R2值為0.85（圖7C）。這均顯示了Incucyte®趨化實驗結果的良好重復性。
圖7. Incucyte®趨化檢測的重復性
Incucyte® 高通量趨化檢測的自動化整合
前面THP-1、DC、T細胞和貼壁腫瘤細胞檢測的案例證明Incucyte® 趨化檢測的應用廣、結果可信且重復性好，可用于癌癥轉移和免疫招募等相關疾病的藥物篩選中。雖然Incucyte® 趨化檢測相比傳統Boyden小室已實現實時檢測和自動定量，但整個實驗流程中仍涉及孔板包被、稀釋、移液和孔板轉移等手動操作步驟，基于此，BMS利用實驗室自動化整合了一個高效的流程來建立自動趨化檢測平臺（圖 8A）。以SDF-1α介導的Treg細胞趨化為例，8種CXCR4拮抗化合物自動和手動性檢測的IC50具有良好的相關性（R2為0.88，Z’因子為0.6，圖8B），說明該自動趨化檢測平臺的準確度和穩定性高。
圖8. 整合Incucyte® 的自動趨化檢測平臺
傳統的Boyden小室需要很高的接種細胞密度且是終點測定，需要用棉簽等去除小室內未遷移的細胞，對小室下表面的細胞手動進行固定、染色、成像和計數，步驟繁瑣。Incucyte® 小室內半透膜孔的密度低，所需接種的細胞數更低，對于原代或分化來源的珍貴樣本更友好，且上、下室趨化因子的濃度差維持時間更長，可以進行更長時程的檢測。Incucyte® 對小室的上下表面連續成像檢測，不需要摸索檢測時間點，可以導出已遷移和/或未遷移細胞的圖片或動態視頻，自動定量細胞遷移曲線，通過曲線斜率反應細胞趨化的速度。整個實驗流程人為操作少，結果的準確度和重復性好，且可以進行自動化整合，實現更高通量的篩選需求（如下表）。
傳統Boyden小室 | Incucyte | ||
接種密度（細胞/孔） | 50,000 | 1,000（貼壁細胞） 5,000（懸浮細胞） | |
趨化因子濃度差維持時間 | 12-24h | 72h | |
自動連續檢測 | 否 | 可以 | |
細胞染色 | 需要 | 不需要 | |
自動定量 | 否 | 可以 | |
自動化整合 | 否 | 可以 | |
除了文中提到的T 細胞（Treg細胞、活化的T細胞）、iDC 、mDC、THP-1和 MDA-MB-231 細胞，BMS公司還構建了包括B 細胞、mTh17、中性粒細胞、巨噬細胞、A549 和 NHLF細胞在內的多種細胞類型的Incucyte® 趨化檢測模型。這些模型被廣泛應用于免疫、腫瘤、心血管和纖維化相關的多個藥物研發項目中。
為什么要用Incucyte® 實時活細胞分析系統呢？
培養箱內可長達數周的連續觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細胞的傷害；只要放好您的細胞，其他交給Incucyte® 吧
6個板位，分別獨立設置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標多參數
大于100種優化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文獻超過12000篇
-參考文獻-
Chen J, Ribeiro B, Li H, Myer L, Chase P, Surti N, Lippy J, Zhang L, Cvijic ME. Leveraging the IncuCyte Technology for Higher-Throughput and Automated Chemotaxis Assays for Target Validation and Compound Characterization. SLAS Discov. 2018 Feb;23(2):122-131. doi: 10.1177/2472555217733437. Epub 2017 Sep 28. PMID: 28957636.