TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒樣品應(yīng)該如何準(zhǔn)備

樣品準(zhǔn)備

A. 石蠟包埋組織切片

1）室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5min，重復(fù)一次，以*脫掉石蠟。

2）室溫下用100%乙醇浸泡切片5min，重復(fù)一次。

3）室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3min。

4）用PBS輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

6）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

B. 組織冰凍切片

1）將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育15min。

2）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

3）將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15min。

4）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

5） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

6）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K工作液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10min。

【注】：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

7）用PBS溶液潤洗樣本2-3次。

8）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒樣品應(yīng)該如何準(zhǔn)備

C. 細(xì)胞爬片的準(zhǔn)備

在Lab-Tek載玻片小室（Chamber Slides）上培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。在凋亡誘導(dǎo)處理之后，用PBS洗2遍載玻片。

D. 細(xì)胞涂片的制備

1）準(zhǔn)備多聚賴氨酸包被的載玻片：吸取50–100 μl 0.01% (w/v)多聚賴氨酸水溶液，滴至每一片預(yù)清洗過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細(xì)胞的區(qū)域?qū)⒍嗑圪嚢彼崛芤和可橐槐印４d玻片晾干之后，迅速用去離子水漂洗，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干30-60 min。包被后的載玻片能在室溫儲存數(shù)月。

2）以約2×10⁷個細(xì)胞/ml的濃度將細(xì)胞重懸于PBS中，吸取50-100μl細(xì)胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細(xì)胞懸液。

3）固定細(xì)胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min。

4）洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5min。重復(fù)用PBS洗一次。

5）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。這時，可用石蠟筆或指甲油在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標(biāo)記操作。在實(shí)驗(yàn)過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

6） 配制Proteinase K工作液：按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2mg/ml的Proteinase K溶液，使其終濃度為20μg/ml。

7）每個樣本上滴加100μl上述Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5min進(jìn)行通透處理）。

【注】：Proteinase K幫助組織和細(xì)胞對后續(xù)步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。未得到更好的結(jié)果，可能需要優(yōu)化Proteinase K孵育的時間。

8）在盛有PBS溶液的敞口燒杯中浸沒清洗樣本2-3次。

9）輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

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