介紹
01
為加快糧食產業經濟發展，推進糧食產業供給和結構性質改革，國家糧食局推出“優質糧食工程"，并開展“中國好糧食"行動。睿科集團積極響應政策的同時，憑借豐富的實驗室經驗，針對相關政策標準制定了系列解決方案，并將各種自動化設備應用于前處理過程，盡可能地幫助實驗員提高工作效率，保證糧油產品檢測的準確性。
值此世界糧食日（2021年10月16日）來臨之際，我們分享用Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀分析糧油中玉米赤霉烯酮的解決方案。試樣經過90%乙腈水溶液提取，提取液經離心、稀釋后用含有玉米赤霉烯酮特異抗體的免疫親和柱自動凈化。用5 mL水淋洗柱子將免疫親和柱上的雜質除去，以甲醇洗脫免疫親和柱。將洗脫液在55°C條件下氮吹干，用1 mL初始流動相定容，經高效液相色譜儀上機分析。
圖-1玉米赤霉烯酮結構式
本應用文章參考GB5009.209-2016《食品中玉米赤霉烯酮的測定》第一法，采用免疫親和柱凈化，高效液相色譜檢測，建立了復雜糧油樣品基質中玉米赤霉烯酮高靈敏度的前處理和分析方法，得到四種常見糧油基質中玉米赤霉烯酮的加標回收率在88.0%-112.0%之間，RSD值小于5%。
儀器與耗材
02
Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀 ；
Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀；
玉米赤霉烯酮免疫親和柱 (Romer，1500ng/3mL)；
高效液相色譜: Waters ACQUITY UPLC I-Class配備大體積流通池；
甲醇（Merck，色譜純）；乙腈（Merck，色譜純）；吐溫-20（Sigma，試劑純）；超純水（Waston）；
PBS鹽包
配標
凈化
濃縮
標準曲線配制
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使用Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站可實現標準品的全自動化配制，將單標母液(1000 mg/L)通過工作站的直接稀釋模式，配制成濃度為10 mg/L的工作中間液，緊接著可通過程序設置，吸取該工作液，配制一條濃度分別為0.01 mg/L，0.02 mg/L，0.1 mg/L，0.2 mg/L和0.5 mg/L的標準工作曲線。
圖-2. Auto Prep 200 液體工作站配標程序
樣品提取與前處理
04
大米、玉米、小麥樣品
準確稱取5 g粉碎過的樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v)，渦旋震蕩提取20 min，以7000 r/min的轉速離心5 min；取5 mL上清液于試管中，加入20 mL 0.1%吐溫-20的PBS緩沖液混勻，以7000 r/min的轉速離心5 min，取10 mL上清液于80 mL上樣管中，待用。
玉米油樣品
準確稱取5 g樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水溶液(9:1)(v/v)，渦旋震蕩提取20 min，以5000 r/min的轉速離心5 min；余下步驟同上。
固相萃取凈化條件
全自動固相萃取儀 | Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀 |
固相萃取柱 | 玉米赤霉烯酮免疫親柱 (1500ng/3mL) |
淋洗 | 超純水 |
洗脫 | 甲醇 |
表-1 固相萃取凈化條件
以2 mL/min的速度精確上樣10 mL待測液，5 mL水清洗樣品瓶，5 mL水淋洗免疫親和柱，氣推30 mL吹干免疫親和柱，推速為80 mL/min。最后用2 mL甲醇以0.5mL/min的速度洗脫樣品，收集洗脫液用Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀于55°C、1 L/min條件下吹干，用初始流動相定容至1 mL，過濾膜上機分析。詳細步驟見圖-3。
圖-3. Fotector Plus 玉米赤霉烯酮免疫親和柱凈化方法
檢測條件
05
色譜柱 | Waters BEH-C18(2.1×100 mm,1.7 um) |
流速 | 0.200 mL/min |
流動相 | 水:甲醇:乙腈=46:8:46 |
柱溫 | 35°C |
進樣體積 | 10 μL |
梯度洗脫 | 等度洗脫 |
熒光檢測器 | 激發波長303nm，發射波長440nm |
表-2 玉米赤霉烯酮液相色譜檢測條件
樣品測試
06
分別取大米、玉米、小麥樣品各5g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標準品，進行上述步驟的前處理凈化。
取空白玉米油樣品5 g，添加20 ug/kg的玉米赤霉烯酮標準品，進行上述步驟的前處理凈化。
樣品回收率如下表-3所示：
表-3添加水平為20 ug/kg樣品回收率結果
結果與討論
07
1.樣品提取液pH對回收率的影響
只用純水稀釋樣品提取液進行上述凈化步驟，樣品中的加標回收率只有71-78%；若采用0.1%吐溫-20的PBS緩沖液進行樣品提取液稀釋，樣品回收率為88-112%。
2.洗脫速度的影響
采用1 mL/min的洗脫速度，洗脫效果不佳，回收率在72%-81%；降低洗脫速度至0.5 mL/min，洗脫效果有明顯提升，回收率在88-112%。因此洗脫速度不宜設置得過快。
3.乙腈提取液用PBS緩沖液稀釋后容易變渾濁，用濾紙過濾混合液效果不佳，因此建議采用高速離心的方式使混合液變澄清以利于后續的過柱。
4.谷物中離心完成后，不可放置過長時間，否則谷物容易重新吸水，可能導致提取液的濃度過高，使樣品的回收率偏高，影響測試結果。
5.固相萃取進行提取液凈化前，特別對于偏酸或偏堿性樣品，應用PBS緩沖溶液（pH=7.4）進行稀釋后上機，否則可能會導致回收率偏低。
總結
1. 采用高通量全自動固相萃取儀法，準確性、重復性、再現性均滿足符合GB 5009.209-2016 要求。
2. 采用Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀對樣品進行檢測能同步進行6個樣品凈化，連續自動處理60個樣品，做樣通量高；同時可無人值守，提高了工作效率。此外還可避免工作人員因操作失誤導致的檢測偏差。
3. 睿科 Auto Prep 200全自動液體工作站可實現混標、標準曲線的自動配制，全程無需人為值守，讓實驗人員遠離有毒有害的化學物質。
4. 睿科Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀處理通量高，80個樣品可同時進行氮吹，實驗平行性好；采用氮吹針自動追隨液面的設計，無需手動調節氮吹針且耗氣量小，省時省力。
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