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分光光度計的使用
我們這里討論瑯伯-比爾定律的限制性條件。其一：通過溶液的光必須是平行的；其二：通過溶液的光必須是單色光；其三：待測溶液必須是純凈的、均勻的且濃度不宜過高，這是瑯伯-比爾定律首要的三個前提條件。但是在實際的分光光度計的制造和使用過程中這三個條件是不可能達到的。其一：因為光是直線傳播的，在分光光度計制造過程中，燈源發出的光是發散的，經過聚焦鏡進行聚焦等直到經過溶液的整體過程中，光是不可能平行的。其二：燈源發出的光是復合光，經過狹縫，再經過光柵分光等步驟，因為受到狹縫和光柵本身的限制，光柵分光不可能達到純單色光。還有光度計的整體設計問題，光度計不可能沒有其它的雜光存在。其三：用戶的溶液也不可能是純凈的，也會含有一些雜質，這些對光度的吸收都會存在影響。除以上三個方面的影響外，在實際的光度計應用過程中還會存在其他因素的影響，例如：1、經過比色皿的光是否垂直；2、比色皿寬度是否為10mm的標準值；3、測試波長是否準確；4、程序設計是否存在漏洞等等，都會直接影響到利用瑯伯-比爾定律計算出的結果。
所以在日常的測試過程中，得出的結果和瑯伯-比爾定律有些偏差是很正常的，只是我們關注偏差多少的問題。
二、分光光度計使用的外部環境要求
分光光度計屬于精密儀器，應當妥善保管和精心維護，這樣才能保證分光光度計長期使用、長期的穩定可靠、測量精度高。元析公司在多年的生產和應用的過程中，得到了一套在一定環境下維護分光光度計的經驗，具體如下：
1、環境溫度在條件容許的情況下，盡量保持在15-30攝氏度之間，這樣能保持電器件穩定工作，不易老化，使分光光度計不易損壞，燈源的使用壽命得到延長。若條件不容許，在高溫的情況下，縮短開機時間，使用分光光度計，使電器件不要長期保持在高溫下。在低溫下，使預熱時間比常溫下的預熱時間要長，這樣能保證在儀器穩定的情況下進行測試。
2、環境濕度在條件容許的情況下，盡量保持在60%以下，這樣能保證光度計內部的光學件和電器件不易受潮、腐蝕、和上霉。若條件不容許，在高濕度和低濕度的情況盡量保持通風。
3、環境在條件容許的情況下盡量保持潔凈，打掃環境時動作不宜太大，不要揚起灰塵，打掃之前用防塵罩蓋上分光光度計，不要讓灰塵進入分光光度計內部。
以上僅就儀器使用的外部環境作了描述，以供使用用戶參考。
三、吸光光度法及722 型分光光度計的使用
吸光光度法
基于物質對不同波長的光波具有選擇性吸收的能力而建立起來的分析方法。
（一） 光線：
光線的波長： 200nm-400nm 紫外線*
400-750nm可見光*>750nm 紅外線
光具有波粒二相性，波長不同，其能量不同。
（二） 物質的吸收光譜及顏色：
1． 物質的原子吸收光譜和原子發射光譜：原子的zui外層電子可以選擇性吸收特征波長的電磁波成為
激發態而產生的光譜稱為原子吸收光譜。激發態原子恢復到基態，則釋放出特征波長的光子，形成原子發射光譜。不同的溶液其光譜不同，即不同溶液對不同波長的光其吸收能力不同，對某一特定波長的光存在吸收峰。
2． 可見光由赤橙黃綠青蘭紫等能量不同的光線組成，當可見光穿過某一溶液時，由于特定波長的
光被吸收而使溶液呈現相應的顏色。（如CuSO4由于吸收了可見光中的黃光（600nm）而成藍色）不同顏色的溶液對不同波長的光其吸收能力不同。
（三） 光吸收的基本定律（Lambert-Beer 定律）：
一束平行單色光（Io）通過有色的透明溶液時，一部分的光可以透過溶液（It），另一部分被溶液吸收（Ia）,還有一部分被器皿表面反射（Ir）,則：
Io=It+Ia+Ir 。那么，該溶液透光率為: T = It / Io 。
1． Lambert 定律：設有一束平行單色光,通過液層厚度為b 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k2b
k2 為吸光系數，為常數。與入射光波長、溶液性質、濃度和溫度有關；A 為吸光度（又稱光密度
O.D 或消光度E），當入射光波長、吸光溶液的濃度和溫度一定時，A 與b 成正比。
2． Beer 定律：設有一束平行單色光,通過濃度為c 的均勻透明溶液,則溶液對光的吸收能力:
A=Ig（Io/It）=Ig（1/T）=k4c
k2 為常數。由Beer 定律可知：當入射光波長、吸光溶液的厚度和溫度一定時，A 與c 成正比。
3． Lambert-Beer 定律：綜合1.2.得： A=Kbc ,
即：當入射光波長、吸光溶液的性質和溫度一定時，A 與b、c 成正比。
（四） 吸光光度法的基本原理：
1、 不同物質，由于其分子結構和原子組成不同，故對光的吸收光譜不同（如：CuSO4），在測定不同顏
色的物質濃度時要用zui大吸收的波長的入射光，這樣測量的靈敏度zui高。
2、 同一種物質，若濃度不同，則對同一波長的入射光的吸收能力（吸光度）也不同，且成正比關系。
3、
應此，利用特定波長的單色光（通常用zui大吸收波長的入射光）照射不同濃度的某一溶液時，所得的吸光度大小應與溶液濃度呈線性關系，故可利用該線性關系通過計算或查標準曲線來求得未知溶液的濃度。
（五） 吸光光度法特點：
1． 靈敏度高：mg%級、甚至ug%級。
2． 準確度高：誤差2-5%
3． 操作簡便、快速，儀器設備不復雜，價格低廉，故應用廣泛。
分光光度計的使用：
（一） 分光光度計的基本原理：利用吸光光度法的原理，采用棱鏡或光柵等分光器獲得純度較高的單色光
來測量未知溶液的濃度的方法。
（二） 常用分光光度計：可見光、紫外、紅外分光光度計，
熒光分光光度計，火焰分光光度計等。
（三） 722 型分光光度計的結構（略）
（四） 分光光度計的操作步驟
1）預熱儀器。為使測定穩定，將電源開關打開，使儀器預熱20min，為了防止光電管疲勞，不要連續光照。預熱儀器時和在不測定時應將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷。
2）選定波長。根據實驗要求，轉動波長調節器，使指針指示所需要的單色光波長。
3）固定靈敏度檔。根據有色溶液對光的吸收情況，為使吸光度讀數為0.2-0.7，選擇合適的靈敏度。為此，旋動靈敏度檔，使其固定于某一檔，在實驗過程中不再變動。一般測量固定在“1”檔。
4）調節“0”點。輕輕旋動調“0”電位器，使讀數表頭指針恰好位于透光度為“0”處（此時，比色皿暗箱蓋是打開的，光路被切斷，光電管不受光照）。
5）調節T=100％。將盛蒸餾水（或空白溶液或純溶劑）的比色皿放入比色皿座架中的*格內，有色溶液放在其它格內，把比色皿暗箱蓋子輕輕蓋上，轉動光量調節器，使透光度T=100％，即表頭指針恰好指在T=100％處。
6）測定。輕輕拉動比色皿座架拉桿，使有色溶液進入光路，此時表頭指針所示為該有色溶液的吸光度A。讀數后，打開比色皿暗箱蓋。
7）關機。實驗完畢，切斷電源，將比色皿取出洗凈，并將比色皿座架及暗箱用軟紙擦凈。
注意事項：
1）為了防止光電管疲勞。不測定時必須將比色皿暗箱蓋打開，使光路切斷，以延長光電管使用壽命。
2）比色皿的使用方法：
①拿比色皿時，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，不要碰比色皿的透光面，以免沾污。
②清洗比色皿時，一般先用水沖洗，再用蒸餾水洗凈。如比色皿被有機物沾污，可用鹽酸-乙醇混合洗滌液（1∶2）浸泡片刻，再用水沖洗。不能用堿溶液或氧化性強的洗滌液洗比色皿，以免損壞。也不能用毛刷清洗比色皿，以免損傷它的透光面。
每次做完實驗時，應立即洗凈比色皿。
③比色皿外壁的水用擦鏡紙或細軟的吸水紙吸干，以保護透光面。
④測定有色溶液吸光度時，一定要用有色溶液洗比色皿內壁幾次，以免改變有色溶液的濃度。另外，在測定一系列溶液的吸光度時，通常都按由稀到濃的順序測定，以減小測量誤差。
⑤在實際分析工作中，通常根據溶液濃度的不同，選用液槽厚度不同的比色皿，使溶液的吸光度控制在0.2～0.7。
四、分光光度計的性能檢查
（1）波長校正：使用光電比色計或分光光度計，在更換光源燈、重新安裝、搬運或檢修后，以及儀器工作不正常時，都要進行波長校正。就是正常工作的儀器，每隔一個月也要檢查一次波長，必要時進行校正，這樣才能保證波長讀數與通過樣品的波長符合，保證儀器的zui大靈敏度。方法常用譜釹濾光片校正法，適用于721型儀可見光區的波長校正，常以585nm或529nm處的吸收峰或T%為標準。鑒于721型儀器的出射光波長較寬，不易將573nm和585nm的兩峰或兩谷分開，校正時易產生誤差，故推薦用529nm處的峰或谷為標準來進行波長校正。校正時，將儀器按要求預熱。要求電源電壓穩定。波長度盤置580nm處，T%調至zui大，在比色杯處放一白紙條，觀察是否有光強均勻、邊緣無光暈或雜光的光斑，如不符合要求，可調節燈泡位置使其符合要求，是為波長校正的粗調。再把靈敏度扭置于“1”（zui低檔），波長度盤對準529nm，電表機械零點為零，在光路空白時調T%為100%T，并反復查零點和100%T穩定情況。將譜釹濾光片插入光路，慢慢旋轉波長度盤，找到透光率zui低的一點（向左右微旋波長度盤時，該點透光率值均增加），這一點即為波長529nm。檢查波長度盤的指示值是不是529nm，如指示值為534nm，此時波長工誤差為5nm，超出規定（±1nm）必須進行調整。調整方法：將波長度盤對準529nm，從光路取出譜釹濾光片，光路空白時調電表指針到100%T，再將譜釹濾光片插入光路。打開儀器左側小蓋板，找到波長校正螺絲（3個中左側柄長的一個）；反時針方向微微調節（負誤差時順時針方向），使電表指針的指示T%為zui低。反復檢查波長誤差情況，直到符合儀器技術指標為止。蓋好左側小蓋板，校正結束。
有些儀器如島津UV-260型雙光束分光光度計，可使用氫燈或置譜釹濾光片于測定比色槽內，編入濾工掃描程序后，儀器即可自動地在一定波長范圍內進行波長校正。分光光度儀的光學系統密封在一個單元組件內，若發生故障，波長不準，常須請制造商派專人修理。其它尚有譜線校正法、干涉濾光片校正法和有色溶液校正法等，可參考有關資料。
（2）線性檢查：線性檢查包括儀器線性及測定方法線性兩個方面的檢查。線性誤差表現為溶液的濃度與吸光度不成線性關系，出現正偏離或負偏離的現象。這種偏離，按比耳定律的現象來自兩個方面：一是溶液本身不符合比耳定律，這種現象叫做化學偏離；二是儀器本身各種因素的影響，使吸光度測定值與濃度之間不成線性關系，這種現象叫儀器偏離。此處研究的是后者。儀器偏離的因素很多，如雜光、有限帶寬、檢測器噪聲、環境條件變化、波長的變動、比色杯的誤差、輻射光的非平行性、檢測器本身的非線性等。
儀器線性檢查常用一種在一定波長及一定濃度范圍內確知其服從比耳定律的有色物質，配成不同濃度的溶液，來檢查儀器本身是否能如實地反映有色物質的濃度變化。這種檢查方法與任何被測物質呈色反應等方法學上的問題無關。用測得的吸光度對濃度作圖，在理想情況下應是一條直線。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文藍濃度系列來檢查，波長用610nm。
（3）雜光（散光）檢查：在吸光度測定中，凡檢測器感受到的不需要的輻射都稱為雜光。雜光對吸光度測定法的準確性有嚴重的影響，但卻往往被忽視。雜光的來源有：①儀器本身的原因，如單色器的設計、光源的光譜分布、光學原件的老化程度、波帶寬度以及儀器內部的反射及散射等；②室內光線過強而漏入儀器，儀器暗室蓋不嚴；③樣品本身的原因，如樣品有無熒光、樣品的散射能力強弱等。
雜光檢測方法：①紫外光區的雜光監測可用10±0.1g/L的碘化鈉溶液，在240nm處測定的吸光度應大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化鉀溶液，在220nm處測其透光度，即為雜光量，一般應小于1%T。以上測定均用石英杯，以蒸餾水校零。②在可見光區可使用譜釹濾光片或硫酸鎳法檢查。先用譜釹濾片校正波長，然后用黑紙片擋住比色杯光路（進口儀器帶有比色杯樣黑色標柱）之后調整0%T，再用空氣做空白調100%T。插入譜釹濾光片，在585nm處測定，其測定值即為雜光水平。
（4）比色杯的質量檢查：比色杯一般由玻璃、石英或熒石制成，光徑1.0或0.5cm,光線通過時有一部分光為空氣與玻璃接觸面的反射而損失（4%），另一部分（很少）為玻璃吸收。比色杯的質量除其原料外，再就是玻璃的厚度均勻，上下一致，各杯彼此相配。廠家多以四個一套供應，且杯口上部外面標有箭頭，箭頭對光源側使用。盡管如此，在使用前還是應作質量檢查。常用伊文藍法：將一定量的2.0mg/L的伊文藍溶液注入比色杯中，比色杯內液面應相等。用一個比色杯作標準，用紅色濾光片（波長600～610nm），用水校零后將此杯的讀數準確調至50%T，接著讀取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范圍內者為合格。
（5）穩定性檢查：檢查方法：將分光光度計及附件接于0.5kVA以上的可調變壓器，先調電壓為220V，波長固定在650nm，在光路比色杯裝以空白液，調讀數為90%T處，再將電壓升至230V及降至190V，觀察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之間為合格。在電源電壓不變的條件下，在3分鐘內其讀數漂移不應超過標尺上限值的±0.5%。
（6）重復性檢查：在波長、工作狀態、電源電壓、比色杯配套等合格的前提下，進行重復檢查。在用交流電源供電時，儀器對一種溶液重復測定的讀數值差應小于或等于標尺上限值的1%。試驗方法：將分析純重絡酸鉀于120～150攝氏度烘干2小時，干燥器中冷卻。精稱509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸餾水溶解并加至刻度，混勻（此液180mg/L鉻）。就用液為30、60、180mg鉻/L。取波長440nm，將應用液各濃度管連續測3～5次，各濃度管中zui大誤差小于1%T為合格。
（7）靈敏度檢查：將重鉻酸鉀液配制成30和32.5mg鉻/L及120和122.5mg/L鉻的4種應用液（濃度差兩組各為2.5mg/L鉻）。波長440nm，以水校零點，將上述應用液連續測3次吸光度，兩組2.5mg/L鉻濃度差的吸光度值差都不小于0.01為合格。（五）722 型分光光度計的使用及注意事項
1、 插上插頭，接通電源，打開暗箱蓋，預熱20min。
* 注意：分光光度計在接通電源而不用時，必須打開暗箱蓋，以免光電管老化。
2、 將準備好的試劑倒入比色杯中，用吸水紙擦去比色杯外側水珠，并依次放入比色杯架中。
* 注意：手拿比色杯毛面，試劑倒入杯中滿2/3 即
可，不得將比色杯放在儀器上。
3、 調節所需波長，靈敏度調至“1”，選擇旋鈕至“T”。
4、 調“0”：打開暗箱蓋，用調“0”旋鈕調節。
5、 調“100%”：蓋上暗箱蓋，用調“100%”旋鈕調節，讓光線通過“空白管”。
6、 重復調“0”和調“100%”數次。
* 注意：若調不到“0”和“100%”，可將靈敏度調至“2”或更高，不得用力強行旋轉旋鈕，以免損壞。
7、 將選擇選扭由“T”調至“A”，此時讀數應由“100”至“0”，若不為“0”，可用“消光零”旋鈕調節。
8、 拉動拉桿，分別讀取“A 標”和“A 樣”。
9、 取出比色杯，棄去溶液，洗凈晾干，備用。
（六） 計算
1．利用標準管計算測定物含量：
A 樣=K 樣b 樣c 樣
A 標=K 標b 標c 標
因為入射光的波長，溶液性質和溫度以及比色杯的
厚度都一樣，即：K 樣=K 標 b 樣=b 標
所以：A 樣/ A 標= c 樣/ c 標
得：c 樣= c 標×A 樣/ A 標
2． 利用標準曲線進行計算：
3． 偏離Lambert-Beer 定律的原因
1） 由于非但色光引起的偏離。
2） 由于溶液本身原因引起的偏離：
① 由于介質不均勻引起的偏離
② 由于溶液中化學反應引起的偏離
實驗：CuSO4 濃度的測定
C 標= 比色波長=650nm
比色結果： A 標= A 樣=
計算：C 樣=C 標*A 樣/A 標