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細胞因子生物學(xué)活性檢測和濃度測定的分析方法

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生物分析法 生物分析法方便,敏感性高,但所有細胞系有可能受幾種細胞因子的影響,特異性則較差。又由于可溶性細胞因子受體等抑制劑的存在,使生物分析法可能低估細胞因子的活性。常用的方法有2種:(1)依賴性細胞株增敏實驗。一些腫瘤細胞株依賴于細胞因子方能在體外增殖,如TF-1細胞株依賴于GM-CSF和IL-3 ,CTLL細胞株依賴于IL-2,TTD-1細胞株依賴于IL-6等。可利用這些依賴株檢測相應(yīng)的細胞因子。但是,并非所有細胞因子均有相應(yīng)的依賴株,因此限制了此法的應(yīng)用。(2)功能檢測實驗。利用一些細胞因子的功能特性而建立相應(yīng)的活性測定方法。如IFN抗病毒實驗和tnf對L 929 細胞的殺傷作用等。此外,生物分析法還有骨髓集落形成實驗,細胞毒或細胞抑制實驗,次級分子分泌的誘導(dǎo),化學(xué)趨化和細胞因子分泌性的抑制實驗等。

免疫分析法 利用抗原機體反應(yīng)的原理,制備出抗細胞因子的單抗或多抗,可進行細胞因子的免疫檢測,它包括放免實驗(RIA)和酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)等。其優(yōu)點是高特異性、高靈敏度、操作簡便。缺點是不能證明被測細胞因子是否為具有完整生物活性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)而非變性蛋白質(zhì)。

CKmRNA的測定 (1)分子雜交實驗:首先制備出細胞因子的基因探針,通過分子雜交檢測細胞內(nèi)CKmRNA的表達。(2)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法技術(shù):可快速、靈敏地檢測表達很低的CKmRNA,并可同時測定同一樣本中多種CKmRNA,操作過程包括細胞因子產(chǎn)生細胞的RNA提取,mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,在細胞因子引物的引導(dǎo)下,即可進行PCR擴增。根據(jù)定量CKmRNA方法和原理的不同,可分為半定量PCR法,競爭性定量PCR法,內(nèi)參標定量PCR法,HPLC-PCR法和酶聯(lián)免疫定量PCR法。目前市售的商品試劑盒已能用于大多數(shù)細胞因子的檢測,但因其價格昂貴而阻礙了其廣泛使用。同時,人細胞因子的測定仍存在許多問題,檢測方法選擇不當可能得到不一致的結(jié)果,有時有必要選擇一個以上的檢測方法測定細胞因子。

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