我們采用兩次酶消化、梯度離心分離得到腦微血管段，探索各種不同的培養條件，成功地進行了較純的小鼠腦微血管內皮細胞的原代培養，內皮細胞純度可達90%以上，而且細胞得率較高，10只動物可培養8~10個35 mm一次性塑料培養皿，培養面積大約80~100 cm2，與國內的一些方法相比，細胞得率有明顯的提高。

 
由于新生鼠易于混有較多的雜細胞且大腦較小以及哺乳期小鼠優于超過1月齡的小鼠，我們采用小鼠腦微血管內皮細胞培養周齡哺乳期的SD小鼠作為培養材料。腦微血管內皮細胞原代培養的關鍵是首先分離獲得純度較高且活力好的腦微血管段。在解剖過程中仔細去除軟腦膜、大血管及大腦白質收集大腦皮質，可減少成纖維細胞和平滑肌細胞的生長，對于提高內皮細胞的純度具有重要意義。由于膠原酶對內皮細胞的損傷較小，我們采用0.1%Ⅱ型膠原酶消化剪碎后的大腦皮質分散組織，同組織勻漿法相比，酶消化法可避免組織勻漿對內皮細胞的損傷，從而有利于提高細胞的活力。經膠原酶消化后采用20% BSA或15%葡聚糖離心可分離腦微血管段與神經組織及大血管，得到底層的腦微血管段，這種方法被廣泛應用于腦微血管段的分離，我們發現20% BSA較15%葡聚糖而言，其分離獲得的腦微血管段數量更多，而且腦微血管段狀態更好更易貼壁生長。由于周細胞是腦微血管內皮細胞原代培養中zui常見的雜細胞，它會明顯抑制內皮細胞的生長，因此原代培養中應盡量減少周細胞的數量，我們采用兩次酶消化方法，控制兩次酶消化的時間，用0.1%膠原酶/消化酶分散出內皮細胞外圍的周細胞，zui后采用一定濃度的連續梯度的Percoll分離以去除周細胞和紅細胞得到較純的腦微血管段。在酶消化過程中加入適量的DNA酶可分散消化過程中釋放的DNA所引起的微血管段凝結塊，有利于增加微血管段的得率。對于Percoll離心，我們嘗試了3個濃度(33%、45%及50%)后發現，濃度越大，腦微血管段離靠近離心管底的紅細胞及周細胞越遠，分離效果也越好，因此采用50% Percoll效果，并且采用水平轉頭的低溫離心機以提高離心效果。內皮細胞純化的其他方法有機械刮除法、克隆培養法、FACS分類法、Thy1.1免疫反應殺傷法、采用血漿來源的胎牛血清、磁珠結合法等，但是我們發現機械刮除法和克隆培養法并不適合大鼠腦微血管內皮細胞的純化，因為原代內皮細胞傳代后狀態不佳且易被雜細胞所抑制，而后面幾種方法比較昂貴不予推薦；血漿來源的胎牛血清不含PDGF，不促進雜細胞的生長，但是其較昂貴，可選擇胎牛血清用于原代培養。
 
腦微血管內皮細胞的原代培養需要涂布明膠、鼠尾膠、纖連蛋白等基質以利于腦微血管段貼壁和內皮細胞的生長。我們嘗試不同基質后發現其對腦微血管段的貼壁和內皮細胞的生長作用不同，纖連蛋白/IV型膠原優于鼠尾膠，而鼠尾膠比明膠好，而且接種密度的要求前者比后兩者要低，后兩者需要達到一定密度才有利于腦微血管段貼壁。另外我們發現內皮細胞不易生長于玻片上，而較易生長于塑料培養皿上，這與文獻報道基本相符。內皮細胞生長需要添加內皮細胞生長因子以促進內皮細胞的增殖抑制雜細胞的生長，我們采用bFGF可有效促進內皮細胞的生長，同時添加100 μg/ml肝素協同bFGF的作用并可抑制平滑肌細胞的生長。同時為了保證內皮細胞的營養，并去除腦微血管段的殘余碎片，我們采用20% FBS的血清濃度并隔天換液。
 
我們培養的腦微血管內皮細胞呈短梭形，區域性單層生長，隨著培養時間的延長及內皮細胞的增殖，可見"漩渦狀"分布，約5~7天后，各區域之間可逐漸融合，其形態和生長特點與大多數文獻報道相似。根據內皮細胞的短梭形的形態特點、Ⅷ因子相關抗原表達陽性可鑒定我們所培養的細胞確為腦微血管內皮細胞。
 
我們的小鼠腦微血管內皮細胞體外培養模型的建立，對于研究腦內皮的生理、生化及藥理研究是一個較好的工具，同時可與星型膠質細胞共培養用于構建血腦屏障模型。相信隨著技術方法的不斷改進，腦微血管內皮細胞體外培養的模型將逐漸接近于其在體特征，并被廣泛應用于相關研究。