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羊水細胞蓋玻片培養法和常規培養法

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1、實驗材料 
2,5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽和棉球、鑷子、20-22號無菌腰穿針、吸管、培養瓶、培養液(PRMI 1640、199、F10、F12)、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、培養皿、蓋玻片等。 
2、培養液配制 
F-12 85% 
小牛血清 15% 
雙抗 100u/ml 
小瓶貯藏 4-8℃ 
3、操作過程 
A(蓋玻片培養法) 
(1)采樣:選擇妊娠13-14周婦女,在無菌條件下抽取羊水5ml,立即注入無菌離心管中;(2)收集:離心分離細胞,1000rpm10分鐘,去上清,留0.5ml,輕打混勻;(3)接種:30mm培養皿中放蓋玻片1張,每片滴混勻的細胞液1-2滴,置培養箱內培養30-60分鐘;(4)培養:取出后從蓋玻片外加培養液2ml,靜置培養48小時后觀察細胞生殖狀況并定時換液,5-10天后,可見大量成纖維細胞或上皮樣細胞生長;(5)終止培養:當有大量圓形發亮細胞出現時,加秋水仙素0.02-0.04ug/ml,作用10-12小時;(6)低滲:倒掉培養液,加預溫37℃0.075MKCL溶液5ml,37℃溫育30分鐘,鏡下可見脹大的羊水細胞,加0.5-1ml 3∶1甲醇:冰醋酸固定液預固定;(7)固定:倒掉低滲液,加5ml固定液固定30分鐘以上,反復3次;(8)干燥:將附有細胞的蓋玻片斜放于培養皿中,置80℃烤箱處理2-3小時;(9)膠片:將附有細胞的蓋玻片用樹脂膠封固于玻片上,正面朝外,小心細胞破壞; 
B(常規培養法) 
(1)—(2)相同于蓋玻片培養法;(3)接種:將混勻的羊水細胞種置于50ml或100ml細胞培養瓶內,平均10ml羊水細胞收集的細胞種置一瓶加5-10ml混合培養液。(4)培養:酒精燈火先封口,靜置培養48小時后觀察細胞貼臂及生長情況,5-10天后可見瓶底面有大量羊水細胞生長;(5)終止培養:同A法;(6)細胞收集:將培養液倒入一干凈離心管中,加0.025%的胰蛋白酶0.5-1ml/瓶,輕輕搖動,使培養瓶底面*接觸消化酶,然后用彎頭吸管吹打,待細胞全部脫落后加前培養液終止胰蛋白酶消化。用吸管移細胞懸液于離心管中。1000-2000rpm10分鐘,棄上清,留細胞沉慮。若一次消化不*,可反復消化;(7)低滲及預固定:加預溫37℃KCL溶液10ml,37℃溫育30分鐘,加0.5-1ml新鮮配制的3∶1甲醇冰乙酸固定液預固定,用氣泡吹打細胞使其混勻。(8)固定:用新鮮配制的3∶2甲冰固定三次,每次30分鐘。固定液加入時沿管壁緩慢加入;(9)制片及干燥:用絨毛制片; 
 

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