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　　浙江中醫藥大學附屬杭州市中醫院胡勁濤等教授在知網發布的《補充腎活躍血方對去勢骨質疏松小鼠骨-血管形成偶聯調節作用的實驗研究》，探討了補充腎活躍血方對去勢骨質疏松小鼠骨量及骨代謝的影響。
 

　　實驗中應用了布魯克Micro-CT儀器，三維重建了小鼠的骨組織形態圖像。
 

　　引言
 

　　絕經后骨質疏松是絕經女性的常見隱匿健康威脅，特征為骨量減、結構退變，骨折風險大增。約半數絕經女性患病，骨質疏松性骨折率18%～23%，嚴重影響生活質量。骨組織血管豐富，血管與骨形成緊密相關，絕經后骨組織血管減少。腎虛血瘀型多見，補充腎活躍血方(基于右歸飲加桃仁、紅花)療效明顯。
 

　　本研究用補充腎活躍血方醫治去勢骨質疏松小鼠，探討其對骨-血管形成及骨代謝的影響。
 

　　實驗前瞻
 

　　一、實驗儀器：
 

　　實驗儀器JB-P5包埋機；RM2016病理切片機；Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統；E100光學顯微鏡。
 

Bruker Skyscan1272
 

　　二、實驗準備：
 

　　實驗動物選取50只4～5周齡SPF級健康雌性ICR小鼠,在室溫(24±2)℃、濕度40%～60%、12 h晝夜交替照明的環境下飼養。
 

　　三、動物分組：
 

　　40只ICR小鼠適應性飼養1周，按隨機數字表法分為假手術組(10只)和去勢組(30只)。
 

　　四、造模：
 

　　去勢小鼠造模采用舒泰80 mg/kg腹腔注射麻醉及阿托品0.04 mg/kg肌注減少氣道分泌物。麻醉完成后剃除小鼠腹部毛發，予以聚維酮消毒3次后鋪無菌巾。取腹部正中切口，逐層切開腹部肌肉及腹膜，沿輸卵管尋找到卵巢，摘除卵巢，縫合傷口。假手術模型行只切除卵巢周圍等量脂肪組織。
 

　　五、術后處理與分組：
 

　　去勢組小鼠行卵巢去勢手術后常規飼養8周，隨機抽取3只小鼠證實骨質疏松造模成功后，隨機取20 只成模小鼠按隨機數字表法分為模型組和中藥組，每組各10只。
 

　　六、給藥:
 

　　假手術組及模型組：等量生理鹽水灌胃。
 

　　中藥組：補充腎活躍血方按小鼠給藥劑量換算得小鼠含生藥劑量為8.6 mg/kg，每日灌胃1次。
 

　　七、樣本收集:
 

　　干預8周后處死，收集樣本。
 

　　八、實驗開展：
 

　　進行Micro-CT、TRAP染色、免疫熒光染色( EM-CN、CD31) 、骨代謝指標檢測。
 

　　實驗過程
 

　　一、Micro-CT檢測骨組織形態
 

　　小鼠處死后，我們收集了股骨標本，并仔細剔除了骨組織周圍的肌肉及肌腱組織。接著，我們使用了Bruker Skyscan1272三維X射線顯微成像系統，按照設定的參數(電流140 μA、電壓70 keV、掃描厚度12 μm)對股骨遠端進行了掃描。隨后，我們應用了Bruker CTAn Micro-CT Software對骨組織形態進行了分析，重點關注的指標包括：骨體積百分比(BV/TV)、小梁數量(Tb.N)以及小梁厚度(Tb.Th)。
 

　　二、TRAP染色觀察破骨細胞數量
 

　　為了觀察破骨細胞的數量，我們對骨組織進行了脫鈣包埋處理，并制成了4 μm厚的石蠟切片。接著，我們進行了TRAP染色，并在顯微鏡下對破骨細胞的數量進行了觀察。為了更精確地分析結果，我們采用了Image J軟件進行了圖像分析。
 

　　三、免疫熒光染色觀察股骨遠端干骺端CD31、EMCN陽性表達
 

　　我們首先對石蠟切片進行了脫蠟、抗原修復和封閉處理。然后，我們進行了一抗(CD31、EMCN)的4 ℃孵育過夜。第二天，我們進行了相應的二抗孵育，并隨后采用了DAPI染液進行染色。在熒光顯微鏡下，我們進行了圖片采集，并再次采用了Image J軟件進行了圖像分析。
 

　　四、骨代謝指標檢測
 

　　為了檢測骨代謝指標，我們收集了小鼠的腹主動脈血液，并通過200g離心力離心5分鐘來收集血清。接著，我們應用了ELISA法檢測了骨形成指標I型前膠原氨基末端肽(PINP)和骨吸收指標抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)。
 

　　實驗結果
 

　　一、各組小鼠骨組織形態的比較
 

　　Micro-CT三維重建圖像顯示假手術組骨小梁較多，模型組骨小梁明顯減少，中藥組較模型組骨小梁增加。見圖1。定量分析結果顯示，假手術組骨體積分數(BV/TV)、骨小梁數目(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)高于模型組和中藥組，而中藥組BV/TV、Tb.N、Tb.Th高于模型組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。
 

圖1 各組小鼠脛骨Micro-CT三維重建橫斷面
 

表1 各組小鼠Micro-CT檢測結果比較
 

　　二、各組小鼠骨組織破骨細胞數量的比較
 

　　骨組織TRAP染色及定量分析顯示，模型組TRAP陽性表達的數目高于假手術組和中藥組，而假手術組TRAP陽性表達的數目少于中藥組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2～圖3。
 

圖2 各組小鼠TRAP染色結果(×40)
 

圖3 各組小鼠破骨細胞定量分析比較
 

　　四、各組小鼠股骨遠端干骺端CD31、EMCN陽性表達血管比較
 

　　應用CD31、EMCN對股骨遠端干骺端進行熒光雙標以檢測H血管的形成情況，結果顯示模型組干骺端H血管的比例相比假手術組明顯減少，中藥組干骺端H血管的比例較模型組增加，但低于假手術組，差異具有統計學意義(P<0.05)。提示補充腎活躍血方可以促進去勢骨質疏松小鼠干骺端血管的形成。見圖4。
 

圖4 各組小鼠干骺端骨組織 CD31 + EMCN 陽性面積比較
 

　　五、各組小鼠血清骨代謝指標比較
 

表2 各組小鼠血清PINP、TRACP水平比較
 

　　結果
 

　　補充腎活躍血方可通過促進骨-血管形成,增加骨生成,減少骨吸收,提高去勢骨質疏松小鼠的骨量。
 

　　絕經后骨質疏松癥(PMOP)的主要癥狀為腰背疼痛、骨畸形和乏力，中醫視其為“骨痿”“骨痹”，認為與腎虛血瘀有關。女子絕經后腎精虧虛，導致骨骼生長維系受影響，形成腎虛血瘀的惡性循環。補充腎活躍血是醫治PMOP的重要原則，補充腎活躍血方通過補充腎健骨、活躍血祛瘀達到醫治效果，研究顯示它能增加去勢骨質疏松小鼠的骨量和骨小梁數量及厚度。
 

　　近年來，研究發現H型血管與骨生長密切相關，H血管減少是PMOP的危險因素。骨質疏松女性血管內皮生長因子表達水平較低，與骨形成指標和骨密度正相關。促進H血管形成可以抑制破骨細胞功能，增加骨形成，預防和醫治PMOP。
 

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