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封閉毛細線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒使用方法：

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

10. 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

膜粘連蛋白6抗體

錨蛋白重復結構域蛋白42抗體

胞環(huán)蛋白肌動蛋白結合蛋白抗體

腺病毒5結合蛋白BS69抗體(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體相關分子1)

載脂蛋白A1抗體

自噬相關蛋白16A抗體

磷酸化自噬相關蛋白4D抗體

磷酸化自噬相關蛋白4C抗體

磷酸化自噬相關蛋白7抗體

磷酸化自噬相關蛋白16A抗體

磷酸化自噬相關蛋白9A抗體

磷酸化自噬相關蛋白4D抗體

磷酸化自噬相關蛋白4D抗體

磷酸化腫瘤血管內皮標志物8抗體

磷酸化自噬相關蛋白4A抗體

磷酸化自噬相關蛋白4C抗體

磷酸化自噬相關蛋白16A抗體

磷酸化蛋白激酶AKT3抗體

磷酸化腎上腺素能受體β2抗體

磷酸化水通道蛋白2抗體

磷酸化自噬相關蛋白3抗體

醛縮酶2抗體

胰腺α淀粉酶抗體

錨蛋白重復結構域蛋白11抗體

磷酸化非受體酪氨酸激酶c-Abl抗體

磷酸化活化復制因子2抗體

醛固酮還原酶家族1成員D1抗體

肝血管生成素相關蛋白抗體

自水解酶結構域5蛋白抗體

溶血磷脂酸?；D移酶β抗體

AFP4b蛋白抗體