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牛羊口蹄疫病毒O型抗體檢測試劑盒（ELISA）

保存條件及有效期

1．試劑盒保存：2-8℃。

2．有效期：6個(gè)月

實(shí)驗(yàn)原理

本試劑盒由預(yù)包被口蹄疫病毒O型抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)記物及其他配套試劑組成，應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（ELISA）原理檢測牛羊血清樣本中口蹄疫病毒O型抗體。實(shí)驗(yàn)時(shí)在酶標(biāo)板中加入待檢樣本和抗體工作液，經(jīng)溫育后洗滌除去未結(jié)合的其他成分后；再加入酶標(biāo)記物，與酶標(biāo)板上抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶標(biāo)記物，在孔中加TMB底物液，若樣品中含有口蹄疫病毒O型抗體則將阻斷抗體工作液與酶標(biāo)板上抗原結(jié)合，從而使后續(xù)反應(yīng)不出現(xiàn)顯色；反之則出現(xiàn)顯色；顯色深淺與樣品中的特異性抗體含量成負(fù)相關(guān)；加入終止液終止反應(yīng)后，產(chǎn)物變?yōu)辄S色；用酶標(biāo)儀在450nm波長測定各反應(yīng)孔中的吸光值， 即可知樣品是否含有口蹄疫病毒O型抗體。

試劑盒組成

序號名稱規(guī)格/96T×1規(guī)格/96T×2規(guī)格/96T×5

1酶標(biāo)記物11ml×1(紅蓋)11ml×2(紅蓋)26ml×2(紅蓋)

2抗體工作液6ml×1(藍(lán)蓋)11ml×1(藍(lán)蓋)26ml×1(藍(lán)蓋)

320X濃縮洗滌液40ml×1(白蓋)40ml×1(白蓋)200ml×1(白蓋)

4底物液A6ml×1(白蓋)11ml×1(白蓋)26ml×1(白蓋)

5底物液B6ml×1(黑蓋)11ml×1(棕蓋)26ml×1(黑蓋)

6終止液6ml×1(黃蓋)11ml×1(黃蓋)26ml×1(黃蓋)

7陽性對照1.0 ml×1(紅蓋)1.5 ml×1(紅蓋)2.0 ml×1(紅蓋)

8陰性對照1.0 ml×1(綠蓋)1.5 ml×1(綠蓋)2.0 ml×1(綠蓋)

9酶標(biāo)板96T×196T×296T×5

10蓋板膜125

11自封袋112

12說明書111

儲存及有效期

2～8℃保存，有效期12個(gè)月。包被板開封后請于2～8℃避光保存，避免受潮。使用期限為2個(gè)月。

適用儀器

含450nm、630nm波長的酶標(biāo)儀，37℃恒溫設(shè)備，可調(diào)微量移液器。

樣品準(zhǔn)備

1.取動(dòng)物全血按常規(guī)方法制備血清，要求血清清亮，無溶血、無污染。樣品1周內(nèi)可于2～8℃保存，長期需置-20℃保存。

2.待檢血清樣本恢復(fù)室溫、混勻待用。陰、陽性對照不用稀釋。

3.濃縮洗滌液使用前應(yīng)恢復(fù)至室溫使沉淀溶解，然后用蒸餾水或去離子水作20倍稀釋成工作洗滌液(如19份蒸餾水或去離子水+1份濃縮洗滌液)。

操作步驟

1.使用前將試劑盒置室溫30分鐘，恢復(fù)至室溫。

2.取所需用量酶標(biāo)板條，設(shè)陰性/陽性對照各2孔，未用的板條盡快密封，2～8℃保存。

3.陰、陽性對照孔分別加入陰、陽性對照50μl；樣品孔每孔先加入45μl工作洗滌液,再加入5μl血清樣本（稀釋比例為1:10）。

4.每孔加抗體工作液50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃（推薦水浴）避光反應(yīng)30分鐘。

5.甩去孔內(nèi)液體，每孔加350 ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。

6.每孔加酶標(biāo)記物100μl，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)30分鐘。

7.洗滌，同步驟5。

8.每孔依次加底物液A、底物液B各50μl，混勻，蓋好蓋板膜，置37℃避光反應(yīng)15分鐘。

9.每孔加終止液50μl，混勻，于450nm(可用630nm作參比波長）測定各孔吸光值（A值）。

參考值

實(shí)驗(yàn)正常的情況下，陰性對照吸光值≥0.8，陽性對照吸光值≤陰性對照吸光值×50%。

檢驗(yàn)結(jié)果的解釋

1.PI（阻斷率）=（1-樣本值/陰性對照孔均值）×100%，PI≥50%為陽性；PI＜50%為陰性。

2.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)表明抗體水平不足，建議補(bǔ)打相應(yīng)疫苗。

試驗(yàn)方法的局限性

該試驗(yàn)僅作為定性檢測牛羊血清中口蹄疫病毒A型抗體，根據(jù)PI值高低可作抗體水平強(qiáng)、中、弱的粗略評估。

注意事項(xiàng)

1.實(shí)驗(yàn)操作時(shí)需戴手套、穿工作衣，嚴(yán)格健全和執(zhí)行消毒隔離制度，各種實(shí)驗(yàn)廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

2.終止液具有腐蝕性，應(yīng)避免接觸皮膚和衣物，如不慎接觸請立即用大量自來水沖洗。

3.酶標(biāo)板從冷藏環(huán)境中取出時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫方可開袋，未用完的酶標(biāo)板需放入有干燥劑的密封袋中保存。

4.濃縮洗滌液在低溫時(shí)容易結(jié)晶，使用時(shí)需恢復(fù)至室溫以完-全溶解。

5.洗滌時(shí)各孔均需加滿液體，防止孔口有游離酶不能洗凈。

6.用于檢測的樣品應(yīng)保持新鮮。

7.試驗(yàn)結(jié)果的判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)。

8.牛羊口蹄疫病毒O型抗體檢測試劑盒（ELISA）不同批號試劑組分不得混用。