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產品簡介：

草地貪夜蛾彈狀病毒(Spodoptera Frugiperda Rhabdovirus，SfRV)，是一種線性負義單鏈 RNA 病毒，其基因組長度為 11000 nt~12000 nt，該病毒顆粒通常為180 nm~200 nm 長，直徑為 70 nm~80 nm 的子-彈狀。草地貪夜蛾彈狀病毒可以通過昆蟲體液或環境中的接觸傳播，也可以通過親本進行垂直傳播。該病毒還能夠在草地貪夜蛾的細胞系中持續感染。它作為一種能感染危害玉米、水稻等作物害蟲的病毒引發了農業及生物學界的關注。因此快速靈敏診斷草地貪夜蛾彈狀病毒具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術為基礎開發的專門檢測草地貪夜蛾彈狀病毒的含內參試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經過優化，分析靈敏度高，可以達到 100 拷貝/反應。

3.提供陽性對照，便于制備標準曲線和用作擴增對照，排除假陰性結果。

4.含識別內源性內參的引物和探針，便于排除 RT-PCR 假陰性結果。

5.特異性高，靶分子的引物和探針是根據草地貪夜蛾彈狀病毒 RNA 高度保守區設計，不會跟其他生物的 RNA 發生交叉反應。

6.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為 5 個數量級。

7.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 RT-PCR 反應。

8.草地貪夜蛾彈狀病毒探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

50T/盒，可滿足一定規模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準確、靈敏等優點。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液、探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2、熒光PCR 專用模板稀釋液、通用內參(1E4 拷貝/μL)、草地貪夜蛾彈狀病毒 qRT-PCR引物-探針干粉（含內參引物探針）、草地貪夜蛾彈狀病毒 qRT-PCR陽性對照(1E7 拷貝/μL)、使用手冊

自備試劑

樣品 RNA。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以陽性對照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

1.標記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1，0。

2.在 0 號管中加入 280 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，35 μL 本試劑盒提供的外源性內參，震蕩一分鐘混勻。外源內參的濃度為 1E4 拷貝/μL。

3.在各管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液。

4.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線陽性樣品，各樣品中外源內參濃度均為 1E3 拷貝/μL。放冰上待用。如需降低外源內參濃度，可在第 2 步時減少加入量。

二、樣品 RNA 的制備

6.如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是制備 NC（樣品制備陰性對照）。可以用確認是陽性的樣本作為陽性對照，用確認是陰性的樣本作為陰性對照。

7.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數 RNA 提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qRT-PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

8.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 RT-PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（直接用第 5 第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

9.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）：

成分樣品管

N+2 個RT-PCR

陰性對照標準曲線樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL

草地貪夜蛾彈狀病毒 qRT-PCR

引物-探針混合液(含內參引物和探針)各 4 μL4 μL4 μL

N+2 個待測樣（含內源性內參）各 5 μL不加不加

超純水不加5 μL不加

第 5 所得標準曲線樣品稀釋液

（含內參，1-6 號）不加不加各 5 μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣

到 3 號管…）

10.蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 RT-PCR：

四、數據處理

11.陰性陽性判斷：沒有 Ct 讀數，或 Ct 大于 40 判為陰性結果。有 Ct 讀數，Ct 值小于 40，熒光信號有對數增長，有典型擴增曲線判為陽性結果。每個樣本需要對FAM 通道和 Cy5 通道的結果分別進行判定，得到兩個結果。

12.實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照 FAM 通道結果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照 FAM 通道結果為陽性，說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進入下一步分析樣本的有效性。

13.樣本有效性判斷：如果樣本 FAM 通道的結果為陽性，則無論內參通道的結果是陰性還是陽性，樣本的結果均有效。如果樣本結果為陰性，內參通道結果也為陰性， 則此樣品的陰性結果無效。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，分別以陽性對照 FAM 通道和內參通道的 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照 FAM 通道讀數的標準曲線為斜線，r2 必須大于 0.95，內參通道讀數的標準曲線為一條跟 X 軸平行的橫線。再以待測樣品的 Ct 值從陽性對照FAM 通道讀數的標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

15.如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其 FAM 通道的 Ct 沒有讀數、或 Ct 大于或等于 40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽性。對任何 FAM 通道結果為陰性的待測樣本，如果其對應的內參通道也為陰性，則此樣品的陰性結果無效，此樣品需要重復實驗。

選擇我們的草地貪夜蛾彈狀病毒探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！