乾思 生物編輯整理：
1.如何選用培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的是AIM V培養基（SFM）。
2.為什么要熱滅活血清？
加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。
3.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？
它在溶液中不穩定嗎？ L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
4.GlutaMAX-I是什么？
培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？ GlutaMAX-I二肽是L-谷氨酰胺的衍生物，將其不穩定的α-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。
5.為什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。
6.如何用臺盼蘭計數活細胞？
用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200-2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。
7.如何消除組織培養的污染？
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1）在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2）分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4）確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2-3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2-3代。
5）在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6）重復步驟4。
7）在無抗生素的培養基中培養4-6代，確定污染是否以已被消除。
8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9.Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？
Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles （2.2g/L）中比在Hanks （0.35g/L） 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。
10.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?
Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：End-Point Determination of Endotoxin Content噬菌體檢驗生物化學檢測 激素的檢測血紅蛋白檢測Sf9 細胞生長促進及方法學檢測
11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？
二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。
12.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎？
是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基（800μl）。（注意以上是35mm培養皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。
13.我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？
如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的*底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。
14.如何檢測內毒素（熱源）水平？
LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的zui敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯反應系統），通過修飾凝集素，產生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）
15.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？
如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。
16. 20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.7817. 室溫下（25℃）配制的
17.Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？
緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。
18. 昆蟲細胞培養的zui適PH值和滲透壓是多少？
生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0-6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的zui適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。
19. High Five細胞有任何其它名稱嗎？
High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。
20.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？
High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
21.High Five細胞用多大的密度凍存？
3.0x10E6 cells/ml
22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。
23.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？
我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性zui小，生活力zui高。通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：1）去除培養基。2） 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.3） 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。4） 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。5） 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）6） 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。7） 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。
24.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？
為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。
25.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？
使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關生長效率分析：當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。細胞毒分析：當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。相關形態學和分化分析：檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。）經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。
26.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？
通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。
如何選用特殊細胞系培養基？
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養是一個好的開始，各種目的無血清培養AIM V（12005）培養基（SFM）。
L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有zui終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。
GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。 GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有zui小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。
什么培養基中可以省去加酚紅？
酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。 如何用臺盼蘭計數活細胞？ 用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200～2000個/毫升，在0.1毫升的細胞懸液中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。
如何消除組織培養的污染？
當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。 高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。 1. 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。 2. 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。 3. 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。4. 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2～3代。 5. 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。 6. 重復步驟4。 7. 在無抗生素的培養基中培養4～6代，確定污染是否以已被消除。
培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？
丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
無菌操作基本技術
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺（至少Class II）。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。
實驗用品
1. 種類?
1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。
1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2 種不同材質，其中polypropylene （PP） 為不透明材質，polystyrene （PS） 為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。
1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗?
2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈后才開始使用。
2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。
3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。
培養基
1. 液體培養基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養基配制（以1 升為例）：
3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清，因此粉末培養基之配制體積為900ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。
3.2. 材料：
3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要）
3.2.2. 粉末培養基
3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
3.2.4. 電磁攪拌器
3.2.5. 無菌血清瓶
3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
3.2.7. pH meter
3.2.8. 真空幫浦
3.2.9. CO2 氣體
3.3. 步驟：
3.3.1. 取粉末培養基溶于700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末（數量依培養基種類而異，表一）溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合。混后溶液之pH應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。（血清亦可加入培養基中一起過濾）
3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。
4.2.3. 去除培養基，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1），室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。
