研究背景

ABC轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter）是一類ATP驅動泵，在人類基因組已發現48種，分為7個亞家族（A-G）。ABC轉運蛋白由兩個跨膜結構域（TMD）和兩個胞質側ATP結合域（NBD）組成。TMD通過構象變化實現分子跨膜轉運，NBD結合或水解胞漿中的ATP，確保轉運底物所需能量。而在ABCA亞家族中特-有的結構是胞外結構域（ECD）和調控結構域（RD），尚未在其他亞家族中發現。

南方科技大學龔欣課題組致力于研究ABCA亞家族相關蛋白的三維結構和轉運機制。2017年，龔欣老師作為顏寧教授課題組成員，在Cell雜志首-次報道了ABCA1近原子分辨率的冷凍電鏡結構。近年來龔欣課題組陸續解析了ABCA3、ABCA4的冷凍電鏡結構及轉運機制模型。

ABCA3主要定位于肺泡II型（AT2）細胞內的層狀體（LBs）。肺表面活性劑能夠降低肺泡表面張力，維持正常呼吸。ABCA3參與表面活性劑的生成，其突變會導致表面活性劑缺陷，引發嚴重的肺部疾病，如新生兒呼吸窘迫綜合征、間質性肺炎等。目前還沒有治療ABCA3突變引起的遺傳性疾病藥物。

ABCA4基因只編碼視網膜上特定的ABC轉運體，ABCA4蛋白幾乎只存在于視網膜的視桿細胞的外節盤緣上。現有研究表明ABCA4作為翻轉酶，可以將磷脂酰乙醇胺（PE）和全反式視黃醛（ATR）形成的脂質衍生物—視黃基磷脂酰乙醇胺（NRPE），從外節膜盤的腔內側轉運到細胞質側，通過促進NRPE的轉移，進而促進視網膜再生和生成維生素A。

ABCA4存在于視網膜細胞上，屬于脂質內向翻轉酶，可將NRPE從外節膜盤的腔內側轉運到細胞質側。ABCA4的脂質轉運功能受損，會使得全反式視黃醛ATR和NRPE在外節膜盤的腔內側發生過量積累，引起視網膜退行性疾病，如常見的遺傳性黃斑變性疾病、年齡相關的黃斑變性、色素性視網膜炎和錐桿營養不良等。盡管ABCA4在視覺系統脂質轉運、視循環過程中起著至關重要的作用，但此前對于ABCA4的分子結構、底物識別和轉運機制還缺乏相應的研究。

研究內容

在本研究中，研究人員通過體外重組表達和純化獲得ABCA3蛋白、ABCA4蛋白，測定ABCA3、ABCA4各自的ATP酶活性和相應的酶動力學參數，純化后的蛋白存在與先前報道一致的蛋白切割和糖基化修飾，均表現出強大的ATP酶活性。研究人員通過冷凍電鏡技術，確定ABCA3、ABCA4分別在apo狀態、結合ATP時的三維結構。

01：ABCA3、ABCA4的結構

 ABCA3與ABCA4結構基本相似，兩者最-大區別是ECD結構域的差異。研究發現，ABCA3的ECD只覆蓋堿基的核心區域，ABCA4的ECD結構相對較大，可分為蓋層、隧道層和基底層三層，并且其中一個ECD中存在一個擴展環用于底物結合。

圖1  ABCA亞家族蛋白三維結構

02：ABCA4的底物識別

ABCA4對底物NRPE的識別進一步說明TMD存在底物結合位點。ABCA4的底物NRPE被夾兩個TMD之間，但完-全暴露在脂質雙分子層中，表明脂質底物從管腔膜小葉側向進入跨膜區的底物結合位點。當存在PE時ATR可刺激ABCA4的ATP酶活性，在與NRPE底物的復合物結構中，觀察到NRPE結合位點的準確性。

03：TMD在ABCA3、ABCA4中的構象  

TMD區域內存在“側向通道”，2個側向空腔可作為底物結合位點。本研究驗證了基質從膜內小葉進入的“側向通道”機制。在無核苷酸狀態下，ABCA3的TMDs表現出與ABCA4和ABCA1無核苷酸時相似的側向開放構象，允許脂質底物從2個膜小葉中側向進入TMD。TMD內2個帶正電荷的側向空腔可以作為潛在的底物結合位點，而填充在2個TMD之間空腔中的脂質分子維持著TMD在這種側向開放構象中的穩定性，同時證明側向開放構象是依賴ATP的結合。

04：ABCA轉運機制模型  

ABCA3、ABCA4的構象在結合ATP前后發生相似的變化，通過“側向進入和擠壓”機制轉運脂質分子。當無ATP和底物存在時，TMD表現出V型橫向開放構象，允許NRPE從腔膜小葉橫向進入，識別并結合底物。當結合ATP后，NBD二聚化，TMD的V型側向開放構象伴變成封閉構象，無法與底物結合，將脂質底物擠壓過膜，實現脂質底物的跨膜翻轉。

圖3   ABCA蛋白轉運機制模型

研究結論

本研究通過冷凍電鏡解析ABCA3、ABCA4在不同轉運狀態下的高分辨率三維結構，以及ATP驅動脂質底物轉運過程中的構象變化，揭示ABCA3、ABCA4對脂質底物獨-特的“側向進入和擠壓”的轉運機制，為ABCA3、ABCA4的功能研究以及相關疾病的藥物研發提供重要的結構基礎，也為闡明ABCA轉運蛋白底物識別和轉運機制提供新方向。

義翹神州蛋白結構研究產品

義翹神州成功開發系列無血清細胞培養基產品，可用于HEK293、CHO、昆蟲細胞以及雜交瘤細胞的培養和蛋白表達。所有細胞培養基均為即用型，經過數千種蛋白及抗體表達案例的驗證，具有蛋白表達量高、細胞生長好、質控嚴格、批次穩定性好等特點，已經被多個知-名實驗室用于細胞培養和蛋白表達研究。義翹神州已通過ISO 13485和ISO 9001雙認證，培養基生產的整個過程嚴格按照GMP規范進行管理，部分產品已完成美國FDA DMF備案，全面支持細胞治療、基因治療、抗體藥生產和診斷原料生產等領域的應用。

SMM 293-CD1無血清細胞培養基, Cat: M293CD1

廣泛適用各種HEK293細胞  

高效和高密度轉染  

即用型完-全培養基，不用添加其他組分  

無動物源組分，無血清，化學成分明確