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重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子-β（β-NGF）的實(shí)驗(yàn)標(biāo)記過(guò)程
神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)元系統(tǒng)的發(fā)育和維持至關(guān)重要。NGF已被證實(shí)是一種復(fù)合物，由名為α、β和γ亞基的三種多肽組成。其中，亞基，β-NGF，是一種26.9kDa的蛋白質(zhì)，含有241個(gè)殘基，參與神經(jīng)元的存活和分化。此外，β-NGF還是TRKA受體的配體，而 TRKA 受體是痛覺(jué)和溫覺(jué)神經(jīng)元分化和發(fā)育所的。
標(biāo)記：
1.將細(xì)胞培養(yǎng)基與EdU溶液按照500：1的比例混合，制成2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基。
2.提前將2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基預(yù)熱，然后將150微升2×EdU標(biāo)記培養(yǎng)基與等體積細(xì)胞培養(yǎng)基混合，獲得1×EdU溶液。
【注】：
①不建議替換全部培養(yǎng)基，這樣可能會(huì)影響細(xì)胞增殖的速度。
②配置好的培養(yǎng)基建議現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以沒(méi)過(guò)細(xì)胞為宜。
3.孵育細(xì)胞2h，棄培養(yǎng)基。
【注】：
①培養(yǎng)時(shí)間取決于細(xì)胞的增殖速度和生長(zhǎng)狀態(tài)。
②大多數(shù)腫瘤細(xì)胞以及粘附細(xì)胞系均可采用2h的孵育時(shí)間。
4.以1xPBS清洗細(xì)胞兩次，每次5min, 以除去未摻入DNA的EdU殘留。
【注】：
對(duì)于貼壁不牢的細(xì)胞可降低清洗強(qiáng)度。
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.將細(xì)胞以104-105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板中，加入100μL培養(yǎng)基，含或不含待測(cè)化合物。在CO2培養(yǎng)箱中在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞24小時(shí)。
2.向板中加入10μL不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。
3.在培養(yǎng)箱中將培養(yǎng)板培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（如6、12、24或48小時(shí)）。
4.向板的每個(gè)孔中加入10μL CCK-8溶液。小心不要將氣泡引入孔中。
5.將平板在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)。
6.在讀板之前，在定軌振蕩器上輕輕混勻。
7.使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度。
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