材料與方法

1.1 材料：

• 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）及野生型（WT）小鼠，購自Jackson Laboratory。

• LNPs：由Acuitas Therapeutics提供，包含可離子化陽離子脂質(zhì)、磷脂酰膽堿、膽固醇和聚乙二醇（PEG）脂質(zhì)。

• mRNA：線性或環(huán)狀Fancc mRNA，通過體外轉(zhuǎn)錄合成，并進(jìn)行5'帽結(jié)構(gòu)和3'多聚腺苷酸尾修飾。

1. LNP制備與表征：將mRNA與LNPs按一定比例混合，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備LNP-mRNA復(fù)合物，并測定其粒徑、zeta電位和RNA包封率。

2. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：通過靜脈注射（IV）或股骨內(nèi)注射（IF）將LNP-mRNA復(fù)合物遞送至小鼠體內(nèi)。在不同時(shí)間點(diǎn)收集骨髓、脾臟和肝臟等組織，評估m(xù)RNA的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)水平。

3. 功能驗(yàn)證：通過集落形成實(shí)驗(yàn)評估LNP-mRNA處理對Fancc缺陷HSPCs增殖能力和烷基化劑抵抗性的影響。同時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析HSPCs的免疫表型變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 增殖能力恢復(fù)：

通過集落形成實(shí)驗(yàn)評估了LNP-Fancc處理對Fancc缺陷HSPCs增殖能力的影響。結(jié)果顯示，LNP-Fancc處理顯著增加了Fancc缺陷HSPCs形成的集落數(shù)量（圖1A-C, D-F）。這表明LNP-Fancc處理能夠有效恢復(fù)Fancc缺陷HSPCs的增殖能力。

2.2 烷基化劑抵抗性恢復(fù)：

Fancc蛋白在DNA交聯(lián)修復(fù)中起關(guān)鍵作用，因此Fancc缺陷細(xì)胞對烷基化劑（如DNA交聯(lián)劑）高度敏感。本研究通過評估LNP-Fancc處理對Fancc缺陷HSPCs烷基化劑抵抗性的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證了LNP-Fancc的功能恢復(fù)效果。

結(jié)果顯示，LNP-Fancc處理顯著提高了Fancc缺陷HSPCs對MMC的抵抗性（圖1B-C, E-F）。這表明LNP-Fancc處理能夠有效恢復(fù)Fancc缺陷HSPCs的DNA修復(fù)能力，從而增強(qiáng)其對烷基化劑的抵抗性。

2.3 遞送效率比較：

本研究通過靜脈注射（IV）和股骨內(nèi)注射（IF）兩種途徑將LNP-mRNA復(fù)合物遞送至Fancc缺陷小鼠（Fancc-/-）體內(nèi)。結(jié)果顯示，無論采用哪種注射方式，LNP-mRNA均能有效轉(zhuǎn)染至小鼠骨髓（BM）細(xì)胞。相比IV注射，IF注射在骨髓中的轉(zhuǎn)染效率更高。具體來說，IF注射后，注射側(cè)股骨中LNP標(biāo)記的細(xì)胞比例顯著高于未注射側(cè)股骨及脾臟等系統(tǒng)性分布組織（圖2D-F）。這一結(jié)果表明，直接注射至骨髓腔能夠更有效地將LNP-mRNA遞送至目標(biāo)細(xì)胞。

使用熒光報(bào)告基因mCherry和熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)評估了mRNA在體內(nèi)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，IF注射后骨髓中mCherry的陽性細(xì)胞比例和平均熒光強(qiáng)度（MFI）均顯著高于IV注射（圖3A-D）。

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)進(jìn)一步證實(shí)了這一結(jié)果。IF注射后，注射側(cè)股骨的熒光素酶活性顯著高于未注射側(cè)股骨及脾臟等組織（圖4A-B, E-H）。這些結(jié)果表明，IF注射能夠更有效地實(shí)現(xiàn)mRNA在骨髓中的表達(dá)。

2.7 重復(fù)給藥效果：

為了評估重復(fù)給藥對Fancc缺陷HSPCs功能恢復(fù)的影響，本研究在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了多次LNP-Fancc處理。結(jié)果顯示，多次LNP-Fancc處理能夠進(jìn)一步提高Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化劑抵抗性（圖7A-C）。

Figure 7. Impact of LNPCFancc on Fancc–/– HSPC in vitro proliferation and engraftment potential

綜上所述，本研究通過LNPs遞送mRNA至Fancc缺陷小鼠體內(nèi)，成功實(shí)現(xiàn)了Fancc蛋白的體內(nèi)表達(dá)，并顯著恢復(fù)了Fancc缺陷HSPCs的增殖能力和烷基化劑抵抗性。同時(shí)，LNP處理未引起顯著的免疫原性反應(yīng)，為FA的臨床治療提供了新的策略

討論

本研究通過LNPs遞送Fancc mRNA至Fancc缺陷小鼠體內(nèi)，成功恢復(fù)了HSPCs的功能。這種體內(nèi)蛋白替代療法為FA的臨床治療提供了新的策略。與體外基因療法相比，體內(nèi)遞送mRNA具有操作簡便、無需復(fù)雜基礎(chǔ)設(shè)施和物流支持等優(yōu)勢。

然而，本研究仍存在一些局限性。首先，F(xiàn)ancc缺陷小鼠模型并未自然呈現(xiàn)骨髓衰竭表型，這限制了模型對FA病理生理過程的模擬能力。其次，mRNA的表達(dá)具有瞬時(shí)性，需要重復(fù)給藥以實(shí)現(xiàn)持久療效。未來的研究將探索更穩(wěn)定的mRNA修飾策略以及優(yōu)化給藥方案以提高療效。

本研究通過LNPs遞送mRNA成功恢復(fù)了Fancc缺陷小鼠HSPCs的功能，為FA的臨床治療提供了新的策略。未來的研究將進(jìn)一步優(yōu)化mRNA修飾策略、給藥方案以及評估該療法的長期療效和安全性。

參考文獻(xiàn)：Banda, O., Adams, S. E., Omer, L., Jung, S. K., Said, H., Phoka, T., ... & Kurre, P. (2025). Restoring hematopoietic stem and progenitor cell function in Fancc mice by in situ delivery of RNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy: Nucleic Acids, 36, 1-12.