一、背景

綠膿菌素測(cè)定用對(duì)照培養(yǎng)基基礎(chǔ)可用于綠膿桿菌的綠膿菌素測(cè)定試驗(yàn)。

綠膿菌素（pyocyanin）是由綠膿假單胞菌培養(yǎng)物中產(chǎn)生的綠色色素。

綠膿假單胞菌Pesudomonas pyocyaneum一種細(xì)菌。因其寄生在傷口產(chǎn)生色素（綠膿菌素）而使膿汁呈暗綠色。

綠膿桿菌（p.aeruginosa）屬假單胞菌屬(pseudomonas)，廣泛分布于自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一。

大小為1.5～3.0×0.5～0.8um，g-桿菌。菌體一端一般有一根鞭毛，運(yùn)動(dòng)活潑。

無芽胞，米液型菌株有多糖莢膜或糖萼，具有抗吞噬作用。在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，專性需氧。菌落形態(tài)不一，多數(shù)直徑2～3mm，邊緣不劑齊，扁平濕潤(rùn)。在血瓊脂平板上形成透明溶血環(huán)。液體培養(yǎng)呈混濁生長(zhǎng)，并有菌膜形成。

綠膿桿菌能產(chǎn)生兩種水溶性色素：一種是綠膿素，為藍(lán)綠色的吩嗪類分合物，無熒光性，具有抗菌作用。另一種為熒光素，呈綠色。綠膿素只有綠膿桿菌產(chǎn)生，故有診斷意義。但廣泛使用有效抗生素后篩選出的變異株常喪失其合成能力。

二、檢驗(yàn)原理

蛋白胨和甘油提供碳氮源；氯化鎂和硫酸鉀促進(jìn)綠膿色素和熒光素的產(chǎn)生；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

用法：稱取本品49.4g,另稱取10g甘油,溶解于1000ml蒸餾水中,分裝,121℃高壓滅菌15分鐘,備用。

方法：挑取可疑菌落接種在在綠膿菌素測(cè)定用培養(yǎng)基（PDP）斜面上，培養(yǎng)24小時(shí)，觀察斜面有無色素。如有色素，在試管內(nèi)加氯仿3.0～5.0mL，充分震搖，使培養(yǎng)物中的綠膿菌素提取在氯仿中，待氯仿提取液呈現(xiàn)綠色時(shí)，加1mol/L鹽酸約1mL，震搖后靜置片刻，上層鹽酸溶液中呈現(xiàn)粉紅至紅色實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，否則為陰性。

原理：銅綠假單胞菌能產(chǎn)生的綠膿菌素能被氯仿提取，且在水中溶解度比氯仿大，并且會(huì)發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)，氧化時(shí)堿性呈藍(lán)色，酸性呈紅色。所以加入鹽酸溶液并震搖后，綠膿菌素會(huì)由氯仿轉(zhuǎn)移至鹽酸溶液中，并在酸性環(huán)境中呈紅色。

三、應(yīng)用

用于一株臨床菌通過PA2228基因促進(jìn)銅綠假單胞菌PAO1綠膿菌素產(chǎn)生研究：

每一種微生物都能進(jìn)行種間或種內(nèi)的信號(hào)傳遞。通過這種信號(hào)傳遞,不同菌株之間會(huì)產(chǎn)生一種相互作用,在感染過程中絕大多數(shù)相互作用都會(huì)對(duì)宿主產(chǎn)生不利影響,加大治療的難度。因此,研究多種致病菌之間的作用機(jī)制對(duì)于研發(fā)新的治療藥物及治療策略具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)前期,將銅綠假單胞菌PAO1和實(shí)驗(yàn)室保存的100株臨床菌分別進(jìn)行共培養(yǎng)篩選,發(fā)現(xiàn)一株臨床菌,在共培養(yǎng)情況下能夠促進(jìn)PAO1綠膿菌素的產(chǎn)生,將其命名為E9。為了找出E9作用于PAO1中的基因,構(gòu)建了轉(zhuǎn)座突變體庫(kù),最終篩選出17株目的菌株。共培養(yǎng)時(shí),E9不能促進(jìn)其綠膿菌素產(chǎn)生,但純培養(yǎng)時(shí)綠膿菌素產(chǎn)量與野生型相似或更高。最后進(jìn)行測(cè)序。

根據(jù)篩選的結(jié)果,選擇表型明顯的PA2228基因,將其進(jìn)行缺失突變,得到突變體PAO1（PA2228）。然后,將其與E9進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果顯示:在E9和PAO1（PA2228）共培養(yǎng)時(shí)綠膿菌素產(chǎn)量與PAO1（PA2228）純培養(yǎng)時(shí)一致。

為了排除E9和PAO1（PA2228）共培養(yǎng)時(shí),綠膿菌素不增加是由于PAO1（PA2228）生長(zhǎng)劣勢(shì)的可能性,分別對(duì)野生型與突變體的共培養(yǎng)體系中兩種菌的比例進(jìn)行監(jiān)測(cè)。發(fā)現(xiàn)兩種共培養(yǎng)體系中菌數(shù)比例相似。表明在臨床菌E9和銅綠假單胞菌共培養(yǎng)時(shí)作用于PA2228基因,導(dǎo)致綠膿菌素產(chǎn)量增加。

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