一、背景

擬桿菌屬通用PCR試劑盒是一種生物試劑盒，用于檢測擬桿菌屬的特異性基因。這種試劑盒可以用來確認擬桿菌屬的存在和種類。

二、擬桿菌屬通用PCR試劑盒使用方法

稀釋擬桿菌屬通用PCR試劑盒陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1、注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2、標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3、用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4、在7號管中加入5μL 1×10E8拷貝/μL的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5、換槍頭，在6號管中加入5μL 1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6、換槍頭，在5號管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7、重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

8、如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9、用自選方法純化樣品的DNA。

10、如果只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11、在標記管中按擬桿菌屬通用PCR試劑盒說明書加入各成分。

12、蓋上蓋子后上機，按擬桿菌屬通用PCR試劑盒說明書參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13、具體操作按所用儀器推薦的流程進行。擬桿菌屬通用PCR試劑盒中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的吸收光譜在500 nm，發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

14、如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

15、如果把擬桿菌屬通用PCR試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。

三、應(yīng)用

擬桿菌屬通用PCR試劑盒可以用于實時定量PCR檢測血中腸道菌DNA及快速藥敏試驗的方法學研究：

建立利用實時定量PCR(RQ-PCR)檢測血標本中腸道菌DNA的方法并對臨床標本進行初步檢測，并建立RQ-PCR快速檢測腸道菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對抗生素敏感性的方法，以期能初步了解外科發(fā)熱患者中腸道菌菌血癥的現(xiàn)狀，并建立快速藥敏方法以便有利于指導(dǎo)治療。

選擇脆弱擬桿菌谷氨酰胺合成酶基因作為靶基因設(shè)計引物和TaqMan探針，使用擬桿菌屬通用PCR試劑盒建立20μl的RQ-PCR反應(yīng)體系，采用含靶基因特異性擴增片段的重組質(zhì)粒建立標準曲線，并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因組DNA，建立實時定量PCR檢測血標本中脆弱擬菌DNA的方法學，并對32份外科發(fā)熱患者的標本進行了臨床驗證。結(jié)果顯示引物和探針特異性好，檢測靈敏度為10°拷貝／μl(103CFU／ml)，標準曲線相關(guān)系數(shù)在0.985～0.999之間。

不同濃度的脆弱擬桿菌樣本檢測的平均準確性為(107.30±2.11)％；批內(nèi)及批間重復(fù)性平均變異系數(shù)(CV)分別為(18.44±1.16)％和(19.00±4.47)％。血標本中脆弱擬桿菌DNA平均提取效率為(60.13±5.66)％，提取效率平均變異系數(shù)為(15.62±2.47)％。含有同等量脆弱擬桿菌的臨床血標本存放在-20℃或-70℃6個月內(nèi)，脆弱擬桿菌DNA拷貝數(shù)差異無顯著性(P=0.467～0.840)，該方法可用于臨床標本的脆弱擬桿菌DNA檢測，并具有快速、靈敏、特異、重復(fù)性好的優(yōu)點。

采用此方法學對32例外科發(fā)熱患者的84份血標本進行了實時定量PCR檢測。結(jié)果顯示10個標本檢測到脆弱擬桿菌，陽性率約為11.90％，含量約1.78～9.24×103CFU／ml，所有患者的血培養(yǎng)結(jié)果均為脆弱擬桿菌陰性。

在含有相同濃度大腸桿菌的LB液體培養(yǎng)基和血中，分組加入不同的抗生素，并設(shè)立生長對照，分別培養(yǎng)1、2、3、4小時后提取標本的基因組DNA，以本研究組先前建立的實時定量PCR檢測大腸埃希菌DNA的方法，對標本進行檢測，觀察不同抗生素組和生長對照組的生長曲線，來判定藥敏結(jié)果，并與紙片法進行比較。

結(jié)果顯示實時定量PCR檢測大腸埃希菌在LB液體培養(yǎng)基和健康人全血中對抗生素的藥物敏感性，結(jié)果與常規(guī)紙片法一致，但更快速。

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