在操作大鼠心肌成纖維細胞永生化細胞專用培養基時，需特別注意以下關鍵步驟，以確保細胞培養的穩定性和實驗結果的可靠性。

     首先，培養基的配制需嚴格遵循無菌操作規范。建議在超凈工作臺內進行，避免微生物污染。配制前需檢查培養基成分是否完整，尤其是血清和生長因子的添加比例，需根據細胞狀態和實驗需求調整。若使用凍存培養基，需提前解凍并輕輕混勻，避免反復凍融導致有效成分降解。

     其次，細胞傳代時需控制消化時間。通常使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，消化時間不宜過長，以免損傷細胞膜。消化完成后，需立即加入含血清的培養基終止反應，并輕柔吹打形成單細胞懸液。離心后棄上清，用新鮮培養基重懸細胞，按適當密度接種于培養皿中。

    此外，培養環境的穩定性至關重要。細胞需置于37℃、5% CO?的恒溫培養箱中，保持濕度以防止培養基蒸發。每日觀察細胞狀態，若發現異常（如顆粒增多、空泡化或貼壁不良），需及時排查原因，如培養基pH值變化、污染或血清質量問題。

     最后，廢棄培養基和耗材需按生物安全規范處理，避免交叉污染。定期檢測支原體污染，確保細胞系的純凈性。通過規范操作和細致觀察，可顯著提高永生化心肌成纖維細胞的培養成功率，為后續實驗提供可靠模型。