基因型
F- ompT hsdSB(rB-mB-) gal dcm araB::T7RNAP-tetA
簡(jiǎn)要說(shuō)明
BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞攜帶pLysS質(zhì)粒，具有氯mei素抗性。pLysS含有表達(dá)T7 溶jun酶的基因，T7溶jun酶可以作用于大腸桿菌細(xì)胞壁上的肽聚糖溶解大腸桿菌，能夠降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)，適合表達(dá)毒性蛋白和非毒性蛋白。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū)（DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶），BL21(DE3)pLysS 感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108cfu/μg。
操作說(shuō)明
1、取100μl冰上融化的BL21(AI)感受態(tài)細(xì)胞，加入目的質(zhì)粒并輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。
2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無(wú)菌2YT或LB培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。
4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含抗生素的2YT 或LB培養(yǎng)基上。
5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。
注 意：
1.Brian Caliendo (Voigt 實(shí)驗(yàn)室)報(bào)道過(guò)pCP20質(zhì)粒比較難于轉(zhuǎn)化到這個(gè)感受態(tài)細(xì)胞中，而pCP20轉(zhuǎn)化到其他菌株中都很正常，但是菌體原因未知。
2.即使不加葡萄糖，BL21(AI) 細(xì)胞的araBAD啟動(dòng)子下游的本底蛋白表達(dá)水平仍然很低，加入葡萄糖后能夠進(jìn)一步的降低本底蛋白的表達(dá)水平。
注意事項(xiàng)
1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。
2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2mM均可）。
5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。
建議選擇該菌株進(jìn)行蛋白表達(dá)的條件如下：1.使用T7啟動(dòng)子載體（高拷貝或者低拷貝都可以）進(jìn)行蛋白表達(dá)。2.使用其他BL21進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)，觀察到明顯的細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用。3.表達(dá)一個(gè)已知的毒性蛋白。
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