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Ni-NTA 鎳柱預裝柱

MCE 國際站：Ni-NTA 6FF Prepacked Column

品牌：MedChemExpress (MCE)

存儲條件：4°C 兩年

簡介：MCE Ni-NTA 6FF Prepacked Column 為具有標準接口的預裝柱產品，適用于各類中低壓色譜系統，方便客戶純化細菌、哺乳動物細胞、昆蟲及桿狀病毒等表達的 His 標簽重組蛋白。

概述：MCE Ni-NTA 6FF Prepacked Column 是一種以 6% Ni-NTA His-Tag Purification Agarose 為填料的預裝柱，通過化學方法偶聯了四配位的氮川三乙酸 (NTA) 為配體，螯合鎳離子 (Ni2+) 后，可以形成非常穩定的八面體結構，Ni2+ 處于中心，可以耐受一定濃度的還原劑、變性劑或耦合劑等。本產品具有標準接口，可用于各類商品化的中低壓色譜系統，如 AKTA 等，方便客戶純化細菌、哺乳動物細胞、昆蟲及桿狀病毒等表達的 His 標簽重組蛋白。

描述：

Ni-NTA His-Tag 純化瓊脂糖是一種 6% 高度交聯的瓊脂糖介質，共價偶聯到螯合劑上，該螯合劑通過四個配位點與 Ni2+ 結合，可實現高產量、高純度的多組氨酸標記蛋白純化。Ni-NTA His-Tag 純化瓊脂糖具有低 Ni2+ 泄漏、高蛋白結合能力和穩定性，并且與多種化學品和 pH 值兼容。這使得 Ni-NTA 6FF 預裝柱成為高效純化大腸桿菌、酵母、昆蟲和哺乳動物表達系統中表達的多組氨酸標記蛋白的理想選擇。

操作說明：1. Buffer 的準備：請根據不同的樣品選擇合適的 Buffer，也可根據自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系，基本原則是“低咪唑上樣，高咪唑洗脫"，或者“高 pH 上樣，低 pH 洗脫"。Buffer 在使用前用 0.22 μm 或者 0.45 μm 濾膜過濾除菌。Ni-NTA 6FF Prepacked Column 可以用于可溶蛋白和包涵體蛋白的純化，兩者所需 Buffer 不同。2. 樣品處理細菌或酵母表達的蛋白(1) 挑取單菌落到含有適合抗性的培養基，根據載體使用說明加入相應濃度的誘導劑誘導相應的時間。(2) 表達結束后，收集菌液至離心管中，7000 rpm，離心 15 分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。按照菌體: Lysis Buffer=1:10 (W/V) 的比例將菌體重懸混勻，加入PMSF (終濃度為 1 mM)，加入溶菌酶 (工作濃度為 0.2-0.4 mg/mL；如果表達的宿主細胞內含 pLysS 或 pLysE，可以不加溶菌酶)。也可加入蛋白酶抑制劑，但需確認加入的蛋白酶抑制劑不會影響目的蛋白與 Agarose 的結合。(3) 將菌體沉淀重懸混勻 (如果菌液濃度高，也可選擇加入 10 μg/mL RNase A 和 5 μg/mL DNase I)，放置在冰上，然后冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。(4) 將澄清的破碎液轉移至離心管中，10000 rpm，4oC 離心 20-30 分鐘。取上清，置于冰上備用或 -20oC 保存。酵母、昆蟲和哺乳動物分泌表達可溶性蛋白(1) 將細胞培養液收集至離心管中，5000 rpm，離心 10 分鐘，取上清，棄沉淀。如上清中不含 EDTA、組氨酸和還原劑等物質，可直接加入柱子進行后續操作；如含有 EDTA、組氨酸和還原劑等物質，需用 Lysis Buffer 在 4oC 條件下透析后才能加入柱子。(2) 對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，用 Lysis Buffer 在 4oC 條件下透析后才能加入柱子。包涵體蛋白 (變性條件)(1) 將培養液收集至離心管中，7000 rpm，離心 15 分鐘，棄上清，收集菌體沉淀。(2) 按照菌體: Lysis Buffer (不含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例將菌體重懸混勻，冰浴超聲破碎。(3) 將破碎液轉移至離心管中，10000 rpm，4oC 離心 20-30 分鐘。棄上清，重復步驟 (2) 和步驟 (3) 一次。(4) 按照菌體: Lysis Buffer (含 8 M 尿素)=1:10 (W/V) 的比例將包涵體懸浮起來。(5) 變性條件下進行 His 標簽重組蛋白純化操作。3. 樣品純化 (以 AKTA 為例)Ni-NTA 6FF 是一款用于 His 標簽蛋白純化的預裝柱產品，可用于各種常規的中低壓色譜系統。(1) 將泵管道中注滿去離子水。取掉上塞子，將預裝柱連接至色譜系統，再折斷下口，將預裝柱連接至色譜系統中，并旋緊。(2) 使用 3-5 倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液。(3) 平衡：使用至少 5 倍柱體積的 Lysis Buffer 平衡層析柱。(4) 上樣：利用泵或注射器上樣。為了避免堵塞層析柱，樣品應經離心或使用濾膜 (0.22 μm 或 0.45 μm) 過濾。(5) 洗雜：用 Wash Buffer 沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩定的基線 (一般至少 10-15 倍柱體積)，收集流出組分和洗雜部分。注：在平衡緩沖液加入低濃度咪唑可以提高樣品純度。(6) 洗脫：用 Elution Buffer 采用一步法或線性梯度洗脫。一步洗脫中，通常使用 5 倍柱體積洗脫液；線性梯度洗脫可以用一個小的梯度，例如 20 倍柱體積或更多，來分離不同結合強度的蛋白質。(7) 依次使用 3 倍柱體積的 Lysis Buffer 和 5 倍柱體積的去離子水平衡填料，再用 5 倍柱體積的 20% 乙醇平衡，最后在 20% 乙醇中 4oC 保存。(8) SDS-PAGE 檢測：將純化得到的樣品 (包括流出組分、洗雜部分和洗脫部分)以及原始樣品使用 SDS-PAGE 檢測純化效果。4. 在位清洗 (Cleaning-in Place, CIP)(1) 去除強疏水結合的蛋白、脂蛋白和脂類：使用 5-10 倍柱體積的 30% 異丙醇清洗，接觸時間為 15-20 分鐘，然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用 2 倍柱體積含有去污劑的酸性或堿性溶液清洗，接觸時間為 1-2 小時，然后使用 5 倍柱體積的 70% 乙醇清洗，最后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。(2) 去除離子作用結合的蛋白：使用 1.5 M NaCl 溶液清洗，接觸時間為 10-15 分鐘，然后再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。5. 填料再生當填料使用過程中發現顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要對填料進行鎳離子剝離和鎳離子重掛，即填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子剝離和鎳離子重掛。(1) 加入 2 倍柱體積的 0.2 M 醋酸溶液 (含 6 M GuHCl ) 清洗一次。(2) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(3) 加入 3 倍柱體積的 2% SDS 清洗一次。(4) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(5) 加入 5 倍柱體積的無水乙醇清洗一次。(6) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(7) 加入 5 倍柱體積的 100 mM EDTA (pH 8.0) 清洗一次。(8) 加入 5 倍柱體積的去離子水清洗一次。(9) 加入 5 倍柱體積的 100 mM NiSO4 清洗一次。(10) 加入 10 倍柱體積的去離子水清洗一次。(11) 填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20% 的乙醇中，置于 4oC 保存。

注意事項：1. 請勿干燥或冷凍本產品，以免引起效價降低，降低純化效率。2. 本產品僅限于專業人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品。3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

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