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產(chǎn)品簡介：

辣椒輕斑駁病毒（Pepper Mild Mottle Virus，PMMoV）是一種影響辣椒作物的植物病原性病毒，屬于煙草花葉病毒科。該病毒是一種單鏈正義 RNA 病毒，基因長度約為 6.4 knt。這種病毒在全球范圍內(nèi)對甜椒、辣椒和觀賞辣椒品種構(gòu)成嚴(yán)重威脅，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。辣椒輕斑駁病毒的典型癥狀包括葉片褪綠、發(fā)育不良、果實結(jié)構(gòu)扭曲和塊狀。其傳播途徑主要包括機械傳播和通過受感染的種子傳播。由于該病毒一旦感染植物就無法治療，因此控制這種疾病的最好方法是使用經(jīng)過病原體檢測和處理的種子進行種植。因此快速靈敏診斷辣椒輕斑駁病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測辣椒輕斑駁病毒的含內(nèi)參試劑盒。

產(chǎn)品特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽性對照，便于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和用作擴增對照，排除假陰性結(jié)果。

4.含識別內(nèi)源性內(nèi)參的引物和探針，便于排除 RT-PCR 假陰性樣本。

5.特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)辣椒輕斑駁病毒 RNA 高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。

6.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)量級。

7.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 RT-PCR 反應(yīng)。

8.辣椒輕斑駁病毒探針法 qRT-PCR 試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測需求。

檢測方法

實時熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2、熒光 PCR 專用模板稀釋液、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR探針法引物-探針干粉、辣椒輕斑駁病毒 qRT-PCR陽性對照(1×10E7 拷貝/μL)、使用手冊。

自備試劑

樣品 RNA，超純水，核酸純化試劑盒。

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 24 個月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以陽性對照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。

1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.在各管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是制備 PC（樣品制備陽性

對照），一個是制備 NC（樣品制備陰性對照）。可以用確認(rèn)是陽性的樣本作為陽性對照，用確認(rèn)是陰性的樣本作為陰性對照。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) RNA -提取試劑盒兼容， 也可以選購本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個 RT-PCR 管，其中N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 RT-PCR 陰性對照（用水做模板）， 1 個用于 RT-PCR 陽性對照（直接用第 6 步第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)）：

成分樣品管

N+2 個RT-PCR

陰性對照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1 μL1 μL各 1 μL

辣椒輕斑駁病毒 PCR 引物-探針

混合液(含內(nèi)參引物和探針)各 4 μL4 μL4 μL

N+2 個待測樣（含內(nèi)源性內(nèi)參）各 5 μL不加不加

超純水不加5 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（含內(nèi)參，1-6 號）不加不加各 5 μL（2 號樣

到 2 號管，3 號樣

到 3 號管…）

四、數(shù)據(jù)處理

12.陰性陽性判斷：沒有 Ct 讀數(shù)，或 Ct 大于 40 判為陰性結(jié)果。有 Ct 讀數(shù)，Ct 值小于 40，熒光信號有對數(shù)增長，有典型擴增曲線判為陽性結(jié)果。每個樣本需要對FAM 通道和 Cy5 通道的結(jié)果分別進行判定，得到兩個結(jié)果。

13.實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照 FAM 通道結(jié)果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照 FAM 通道結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進入下一步分析樣本的有效性。

14.樣本有效性判斷：如果樣本 FAM 通道的結(jié)果為陽性，則無論內(nèi)參通道的結(jié)果是陰性還是陽性，樣本的結(jié)果均有效。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性， 則此樣品的陰性結(jié)果無效。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。

15.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，分別以陽性對照 FAM 通道和內(nèi)參通道的 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對照 FAM 通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2 必須大于 0.95，內(nèi)參通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條跟 X 軸平行的橫線。再以待測樣品的 Ct 值從陽性對照FAM 通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

16.如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其 FAM 通道的 Ct 沒有讀數(shù)、或 Ct 大于或等于 40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽性。對任何 FAM 通道結(jié)果為陰性的待測樣本，如果其對應(yīng)的內(nèi)參通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實驗。

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