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產(chǎn)品簡介：

細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化試劑盒是基于超速離心的快速提取細(xì)菌膜蛋白的試劑盒。其原理是裂解細(xì)胞后，通過超速離心分離出細(xì)菌細(xì)胞膜和附著的蛋白質(zhì)。跟傳統(tǒng)的密度梯度離心法和去污劑法相比。

產(chǎn)品參數(shù)：

規(guī)格及成分

保存和運輸

常溫運輸和保存，但 DNase I 干粉需要低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

膜蛋白溶解液(取決于后續(xù)實驗。如果后續(xù)實驗為 SDS-PAGE，則用 1× SDS-PAGE 上樣液作為溶解液；如果用于 2D 電泳，則使用 1×等電點電泳上

樣液作為溶解液)。

使用方法：

準(zhǔn)備：第一次使用本試盒時要將所有 DNase I 干粉倒入 B 中，輕柔顛倒使 DNase I 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一個月內(nèi)完，否則 DNase 將逐漸失去活性。此外，最好在實驗前 1 小時將細(xì)菌膜蛋白純化細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C 冰浴預(yù)冷。

用法一：小量制（用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 等實驗）

1.     收集 20-40 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液（OD420 在 1.5 左右即可），2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2.加入 2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A，輕柔吹打，將細(xì)菌重懸于細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中。

3.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

4.加入 0.5 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌重懸。注：如果細(xì)菌起始量沒有 20-40 mL，細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 中的細(xì)菌可以放-80℃長期保存。

5.用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解，否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過程。

6.2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中（如 BeckmanOptima 臺式超速離心機離心管），棄沉淀（未破裂細(xì)胞）。

7.在上清(細(xì)菌裂解液)中加入 5 mL 預(yù)冷的細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。

8.用 BechmanOptima 臺式超速離心機在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應(yīng)該一致，否則有可能得不到沉淀。

9.小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A，充分吹打混勻。

10.用 BeckmanOptima 臺式超速離心機在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應(yīng)該一致，否則有可能得不到沉淀。

11.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的，跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液(如 1×SDS-PAGE 上樣液中，可從本公司購買)，所得膜蛋白的濃度將在 1 mg/mL 左右。

用法二：大量制備（要用于上樣量比較的 2D 電等實驗）

12.收集 200-400 mL 過夜培養(yǎng)的細(xì)菌飽和培養(yǎng)液(OD420 在 1.5 左右即可)，2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

13.加入 20 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A，輕柔吹打，將細(xì)菌重懸于細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中。

14.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

15.加入 5 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經(jīng)提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細(xì)菌重懸。注：如果細(xì)菌起始量沒有 200-400 mL，細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液A 中的細(xì)菌可以放-80℃長期保存。

16.用超聲或 French Press 方法裂解細(xì)胞，直到 80%以上的細(xì)菌都裂解為止。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細(xì)菌是否已經(jīng)裂解，否則還需要重復(fù)細(xì)菌裂解過程。

17.2500 g 室溫離心 8 分鐘后小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的玻璃燒杯中，棄沉淀(未破裂細(xì)胞)。

18.在上清（細(xì)菌裂解液）中加入 50 mL 預(yù)冷的細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 C， 輕輕在冰浴中攪拌混勻 30-60 分鐘。注：可以在大燒杯中裝冰，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放入干凈的攪拌子，以最-低速度攪拌。

19.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應(yīng)該一致。

20.小心移棄上清，在沉淀中加入 2 mL 細(xì)菌細(xì)胞膜蛋白純化溶液 A，充分吹打混勻。

21.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉(zhuǎn)頭在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應(yīng)該一致。

22.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存或溶解在 1 mL 自備的，跟后續(xù)實驗兼容的緩沖液(如 1×等電點電泳上樣液，可從本公司購買)，所得膜蛋白的濃度在 1 mg/mL 左右。

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