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產品簡介：

細菌細胞膜蛋白純化試劑盒是基于超速離心的快速提取細菌膜蛋白的試劑盒。其原理是裂解細胞后，通過超速離心分離出細菌細胞膜和附著的蛋白質。跟傳統的密度梯度離心法和去污劑法相比。

產品參數：

規格及成分

保存和運輸

常溫運輸和保存，但 DNase I 干粉需要低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

膜蛋白溶解液(取決于后續實驗。如果后續實驗為 SDS-PAGE，則用 1× SDS-PAGE 上樣液作為溶解液；如果用于 2D 電泳，則使用 1×等電點電泳上

樣液作為溶解液)。

使用方法：

準備：第一次使用本試盒時要將所有 DNase I 干粉倒入 B 中，輕柔顛倒使 DNase I 干粉溶解。未用完的部分需要放-20℃保存，最好在一個月內完，否則 DNase 將逐漸失去活性。此外，最好在實驗前 1 小時將細菌膜蛋白純化細菌細胞膜蛋白純化溶液 C 冰浴預冷。

用法一：小量制（用于上樣量比較小的 SDS-PAGE 等實驗）

1.     收集 20-40 mL 過夜培養的細菌飽和培養液（OD420 在 1.5 左右即可），2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

2.加入 2 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于細菌細胞膜蛋白純化溶液A 中。

3.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

4.加入 0.5 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌重懸。注：如果細菌起始量沒有 20-40 mL，細菌細胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細菌細胞膜蛋白純化溶液 A 中的細菌可以放-80℃長期保存。

5.用超聲或 French Press 方法裂解細胞，直到 80%以上的細菌都裂解為止。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌裂解過程。

6.2500g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到新的 10 mL-15 mL 塑料離心管中（如 BeckmanOptima 臺式超速離心機離心管），棄沉淀（未破裂細胞）。

7.在上清(細菌裂解液)中加入 5 mL 預冷的細菌細胞膜蛋白純化溶液 C，輕柔顛倒混勻后冰浴放置 30-60 分鐘。其間可以輕柔顛倒混勻 3-5 次。

8.用 BechmanOptima 臺式超速離心機在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。

9.小心移棄上清，在沉淀中加入 0.2 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液A，充分吹打混勻。

10.用 BeckmanOptima 臺式超速離心機在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致，否則有可能得不到沉淀。

11.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存，也可以直接加入 0.1 mL 自備的，跟后續實驗兼容的緩沖液(如 1×SDS-PAGE 上樣液中，可從本公司購買)，所得膜蛋白的濃度將在 1 mg/mL 左右。

用法二：大量制備（要用于上樣量比較的 2D 電等實驗）

12.收集 200-400 mL 過夜培養的細菌飽和培養液(OD420 在 1.5 左右即可)，2500g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

13.加入 20 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液 A，輕柔吹打，將細菌重懸于細菌細胞膜蛋白純化溶液A 中。

14.2500 g 室溫離心 10 分鐘后棄上清。

15.加入 5 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液 B（必須已經提前加入了 DNase I 干粉），輕柔吹打使細菌重懸。注：如果細菌起始量沒有 200-400 mL，細菌細胞膜蛋白純化溶液 A 的用量可以等比例降低。重懸在細菌細胞膜蛋白純化溶液A 中的細菌可以放-80℃長期保存。

16.用超聲或 French Press 方法裂解細胞，直到 80%以上的細菌都裂解為止。如果用 French Press 方法，則需要處理至少兩次，每次的壓力為 9.65× 10E7(=14000 psi)。注意：不論用哪種裂解方法，都必須在顯微鏡下檢查細菌是否已經裂解，否則還需要重復細菌裂解過程。

17.2500 g 室溫離心 8 分鐘后小心轉移上清到干凈的玻璃燒杯中，棄沉淀(未破裂細胞)。

18.在上清（細菌裂解液）中加入 50 mL 預冷的細菌細胞膜蛋白純化溶液 C， 輕輕在冰浴中攪拌混勻 30-60 分鐘。注：可以在大燒杯中裝冰，然后將裝有樣品的小燒杯放入，在放入干凈的攪拌子，以最-低速度攪拌。

19.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

20.小心移棄上清，在沉淀中加入 2 mL 細菌細胞膜蛋白純化溶液 A，充分吹打混勻。

21.用 Beckman Type 55.2 Ti 轉頭在 115，000 g， 4℃下離心 60 分鐘。也可以使用其他冷凍超速離心機，但離心力應該一致。

22.小心移棄上清，所得沉淀放-20℃長期保存或溶解在 1 mL 自備的，跟后續實驗兼容的緩沖液(如 1×等電點電泳上樣液，可從本公司購買)，所得膜蛋白的濃度在 1 mg/mL 左右。

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