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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

WHO 規(guī)定生物制品中不能含有逆轉(zhuǎn)錄病毒污染，逆轉(zhuǎn)錄病毒種類繁多，故一般通過(guò) 檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)間接檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄病毒存在與否。藥典規(guī)定的檢測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的方法是PERT 法（Product-Enhanced Reverse Transcription），其原理是用待測(cè)樣品代替逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行 RT-PCR，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中是否存在逆轉(zhuǎn)錄酶以及其濃度，進(jìn)而推算出樣本是否含有逆轉(zhuǎn)錄病毒及其濃度。PERT 法根據(jù)酶活性檢測(cè)，普適性廣，可檢測(cè)出 oncovirus、lentivirus 和 spumavirus 等幾大類已知和未知的逆轉(zhuǎn)錄病毒。但常規(guī) PERT 法是兩步法 RT-PCR 加電泳檢測(cè)，操作繁瑣，誤差大，不適合高通量操作。為克服此缺點(diǎn)，本公司開(kāi)發(fā)了一管式實(shí)時(shí)PERT 試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供待測(cè)樣品。

2.操作簡(jiǎn)單快捷，一步加樣操作，變異系數(shù)小，適合高通量操作。

3.實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，一管式反應(yīng)，避免樣本交差污染。

4.靈敏性高，最-低可以檢測(cè)到幾十個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶分子的活性。

5.背景低，本產(chǎn)品所用的 DNA 聚合酶不含背景逆轉(zhuǎn)錄酶活性，使用的 RNA 模板在生命周期中無(wú) DNA 環(huán)節(jié)，不會(huì)自帶污染源。

6.起始樣本可以是細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液和純化的逆轉(zhuǎn)錄酶溶液，可以檢測(cè)到里面所含有的逆轉(zhuǎn)錄酶活性，并由此判斷是否有逆轉(zhuǎn)錄病毒的存在。

7.含逆轉(zhuǎn)錄酶陽(yáng)性對(duì)照，便于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和排除假陰性實(shí)驗(yàn)。

8.定量檢測(cè)的線性范圍至少為 6 個(gè)數(shù)量級(jí)。

9.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的 PERT 反應(yīng)。

10.逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)試劑盒（PERT 法）只能用于科研，包括生物制品和細(xì)胞庫(kù)等質(zhì)檢環(huán)節(jié)。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

成分編號(hào)規(guī)格包裝

PERT 樣品稀釋液12 mL15 mL 本色瓶

MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，200 U/μL

比活：見(jiàn)標(biāo)簽20 μL0.5 mL 紅蓋管

PERT 引物-探針干粉50 次0.5 mL 棕塑管

PERT RNA 模板干粉50 次0.5 mL 白蓋管

2×PERT MasterMix500 μL0.5 mL 綠蓋管

使用手冊(cè)1 份無(wú)

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑

樣品、超純水、蛋白濃度測(cè)定試劑盒。

使用方法：

一、在生物安全柜中準(zhǔn)備用于PERT 的樣品

1.細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備：收集上清液，11,000×g 離心 10 分鐘，0.45 μm 濾膜過(guò)濾， 100,000×g 超速離心 60 分鐘得病毒顆粒。用PERT 樣本-稀釋液重懸病毒顆粒后放冰上待用，此為待測(cè)樣本。每次PERT 實(shí)驗(yàn)可以用 1-5 μL 待測(cè)樣本。

2.細(xì)胞裂解液制備：將洗滌后的 1E6 個(gè)細(xì)胞沉淀重懸在 200 μL PERT 樣本-稀釋液中，冰上放置 20 分鐘裂解細(xì)胞。用自備的試劑測(cè)定蛋白濃度，每次 PERT 實(shí)驗(yàn)需要用0.1-1 μg 蛋白樣本。

二、制備 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶的梯度稀釋液（以 10 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。

3.標(biāo)記 10 個(gè)離心管，分別為 1、2、3、……8、9、10。

4.用帶芯槍頭在 10 個(gè)管中分別加入 45 μL PERT 樣本-稀釋液。

5.在 1 號(hào)管中加入 5 μL MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200 U/μL，試劑盒提供），輕柔吹打 1 分鐘得 1 號(hào)稀釋液，放冰上待用。此為原液的 1E1 倍稀釋液，濃度為 20 U/μL。

6.換槍頭，在 2 號(hào)管中加入 5 μL 1 號(hào)稀釋液，輕柔吹打 1 分鐘得 2 號(hào)稀釋液。放冰上待用。此為原液的 1E2 倍稀釋液，2 U/μL。

7.重復(fù)上面的操作直到得到 10 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，放冰上待用。一般第一次實(shí)驗(yàn)時(shí)先選用 3-8 號(hào)稀釋液共 6 個(gè)樣本，然后根據(jù)結(jié)果再?zèng)Q定后續(xù)實(shí)驗(yàn)是用更低還是更高稀釋度的樣本。上述稀釋的酶標(biāo)準(zhǔn)品在-20℃至少可保存 3 個(gè)月。

三、設(shè)置 PERT 反應(yīng)

8.首-次使用本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)將PERT RNA 模板溶液管渦旋震蕩 30 秒混勻后放冰上待用。沒(méi)用完的模板溶液需放-80℃保存。

9.如果有 N 個(gè)待測(cè)樣本，做 6 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，則標(biāo)記 N+7 個(gè)反應(yīng)管，其中 N 個(gè)管用于 N 個(gè)待測(cè)樣本，多出的 1 個(gè)管用于無(wú)樣本陰性對(duì)照，6 個(gè)用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（也相

當(dāng)于陽(yáng)性對(duì)照）。按下表加入各成分：

成分無(wú)模板對(duì)

照無(wú)樣本對(duì)照N 個(gè)樣品管6 個(gè)標(biāo)曲管

PERT 引物-探針混合液3 μL3 μL各 3 μL各 3 μL

PERT RNA 模板溶液-2 μL各 2 μL各 2 μL

PERT 樣本-稀釋液2 μL2 μL--

超純水5 μL3 μL各 3 μL各 3 μL

N 個(gè)待測(cè)樣本--各 2 μL-

第 8 步所得 MMLV 標(biāo)--各 2 μL

準(zhǔn)品的 3-8 號(hào)稀釋液（需加入到所

對(duì)應(yīng)的管中）

2×PERT MasterMix各 10 μL10 μL10 μL各 10 μL

注意：如果樣本含 DNA 聚合酶，由于部分 DNA 聚合酶也有微弱的 RT 活性，故無(wú)逆轉(zhuǎn)錄酶的樣本也可能出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。用戶可以在每管中加入 2 μL DNA 聚合酶 RT 活性抑制劑予以屏蔽（同時(shí)少加 2 μL 超純水）。該產(chǎn)品需另購(gòu)。

10. 在 PCR 儀上進(jìn)行如下反應(yīng)：42℃ 10 分鐘，95℃ 5 分鐘，（95℃15 秒、52℃ 30 秒、72℃ 30 秒）循環(huán) 35 次循環(huán)。注意：42℃是本產(chǎn)品提供的 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)品的最適溫度，用戶可根據(jù)待測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的最適溫度調(diào)整。如需提高檢測(cè)極限，可延長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄時(shí)間至 100 分鐘，循環(huán)數(shù)可嘗試 45 循環(huán)。

五、數(shù)據(jù)處理

11.實(shí)驗(yàn)有效性判斷：如果無(wú)模板對(duì)照或無(wú)樣本對(duì)照出現(xiàn)了Ct 值并且熒光信號(hào)有標(biāo)準(zhǔn)的倒S 擴(kuò)增曲線，則說(shuō)明試劑或環(huán)境有污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效。如果所有陽(yáng)性對(duì)照（標(biāo)曲管）均無(wú)擴(kuò)增，則說(shuō)明試劑、儀器或操作有問(wèn)題，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)也無(wú)效。實(shí)驗(yàn)無(wú)效時(shí)需要先找到原因后再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果實(shí)驗(yàn)有效，可繼續(xù)后續(xù)的分析。

12.制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（p U/μL，不是 U，下同）的 log

值為橫軸，以 FAM 通道的 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

13.用 N 個(gè)待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出其對(duì)應(yīng)逆轉(zhuǎn)錄酶濃度的 log 值，再用該

log 值計(jì)算出其對(duì)應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄酶濃度，再根據(jù)體積計(jì)算出使用的活力單位。

14.如果知道所測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的重量，則可以計(jì)算出其比活（活性單位/mg）。本批次提供的 MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶的比活見(jiàn)標(biāo)簽。

15.如果知道所測(cè)逆轉(zhuǎn)錄酶的分子量，還可以計(jì)算出每個(gè)逆轉(zhuǎn)錄酶分子有多少活性單位。假設(shè)測(cè)出某 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶樣本比活為 36500 U/mg，由于 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶的分子量為 158 kDa，則 1mg AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶的摩爾數(shù)為 1/1.58E8，其對(duì)應(yīng)的分子數(shù)為 6.02E23×（1/1.58E8）=3.81E15。由于 1 mg 的活力為 35600 U

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