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產品簡介：

致突變 PCR（error-prone PCR）是利用天然 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′ 校對功能的特性，在一定條件下（如不同的 dNTP 濃度、Mg 濃度和 MnCl2 存在）能夠按較高的機率引入隨機引入突變而設計。如果有適當的突變選擇方法，則可從構建的突變庫選出所需突變體，用于人工誘變。本產品就是根據此原理開發得產品。

產品特點：

1.即開即用，十分簡單方便，尤其在生物制藥和酶學研究領域顯示出了它的優-越性。

2.配方經過精心優化，突變率穩定，突變沒有趨向性。致突變 PCR 的突變率為 0.66%

（±0.13%），詳見使用手冊疑難解答。

3.比體內基因突變更快捷簡單，但如果在 PCR 引物中設計位點，則可使產物克隆到表達載體，也可以用于體內蛋白活性的篩選。

4.可用于連續致突變 PCR（sequential error-prone PCR），只需把上一次致突變 PCR 的產物用作下一次致突變 PCR 的模板即可，使每一次獲得的小突變累積而產生重要的有益突變。

5.只適用于擴增 1kb 以下的產物，對于 1kb 以上的產物，建議分段擴增。

6.本產品足夠 100 次 30uL 體系的易錯 PCR 反應。

7.致突變PCR試劑盒只能用于科研。

產品參數：

產品規格

成份規格包裝

10×致突變 PCR Mix（含酶）300 uL0.5mL 紅色蓋

致突變 PCR 專用 dNTP300 uL0.5mL 黃色蓋

致突變 PCR 增強劑300 uL0.5mL 白色蓋

追加 dNTP，0.5mM300 uL0.5mL 本色管

致突變 PCR 專用 MnCl2300 uL0.5mL 綠色蓋

使用手冊1 份無

保存和運輸

低溫運輸，-20℃保存, 有效期為一年。

自備試劑

引物、DNA 模板、超純水。

使用方法：

1.將自備的 PCR 引物稀釋到 10uM。引物是決定致突變 PCR 成敗的關鍵因素，設計引物時要保證其 Tm 在 70℃，長度在 25-30nt 之間，GC 含量在 45%-60%之間，3 端 GC 含量低，并且沒有發夾結構。

2.用自備引物和自備的常規PCR 試劑擴增制備致突變DNA 模板（常規 PCR 產物），

膠回收并準確確定濃度。注意：致突變 PCR 的模板一定要用膠回收的常規 PCR 產物，因為膠回收可以把電泳不可見的非特異性擴增片段去除，否則這些片段由  于也是用致突變 PCR 引物擴增所得，在致突變 PCR 擴增時也會被擴增，產生競爭抑制，降低靶分子的擴增效率。如果致突變 PCR 制備模板的引物和致突變 PCR 引物不同（類似巢式 PCR）則可以避免此問題，但需要合成兩對引物。本試劑盒只適用于擴增 1kb 以下的產物，對于 1kb 以上的產物，建議分段擴增。

3.將回收的 DNA 片段（模板）用水稀釋到 1ng/uL 、10ng/uL 和 100ng/uL 三個濃度。注意：模板使用量是影響突變率的最重要因素，因為模板 DNA 為非突變 DNA，擴增產生的 DNA 為突變 DNA，致突變 PCR 體系跟常規 PCR 一樣， 最后會達到擴增平臺，最終得到的擴增 DNA 的量是固定的，因此起始模板 DNA 使用量越大，則突變 DNA 在最終得到的總 DNA 中的相對比例就越低。但模板太少又不容易擴增成功，所以建議同時測試三個模板用量。如果都成功，則優先選  用模板濃度低的 PCR 產物進行分析。

4.設置 30uL 體系的致突變 PCR 反應。在一干凈的 PCR 管中，加入下列成分。由于 Mn 離子容易跟其他成分發生沉淀反應，因此上機前最后加 MnCl2：

5.立即按下列參數進行易錯 PCR：

步驟參數循環數

PCR 前變性94℃ 3 分鐘循環 1 次

致突變 PCR94℃ 1 分鐘

循環 30-60 次

60℃ 1 分鐘

72℃ 3-10 分鐘

注：由于致突變 PCR 含高濃度的鎂離子，因此引物容易互為模板形成引物二聚體，因此使用 60℃為復性溫度。在錯誤堿基摻入后，DNA 合成會暫時停滯，因此為了讓 DNA 合成繼續，需要延長合成的時間到 3-10 分鐘。致突變 PCR 循環次數越多，突變 DNA（擴增產物）與非突變 DNA（原始模板）的比例就越高。此外在突變率和模板長度恒定的情況下，擴增次數越多，發生突變的絕對數就越  高，在同一模板上發生的突變位點數就越多，所以如果需要，可以做 30、35、40、45、50、55、60 次 7 個循環數的比較。

6.致突變 PCR 結束后，各取 3uL 進行電泳檢查。

7.如果有預期大小的 PCR 產物，則全部電泳，進行膠回收，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的 DNA 為模板，再進行下一輪致突變 PCR。

8.如果沒有 PCR 產物，則按下列操作進行追加 PCR。

9.在致突變 PCR 管中，加入 3uL 追加 dNTP 到 27uL 剩下的致突變 PCR 體系中， 按下表進行追加 PCR（chasing PCR）。

10.追加 PCR 結束后，再電泳檢測。如果有條帶，再進行克隆和測序等后續操作。如果需要增加突變率，可以選擇一個突變后的 DNA 為模板，再進行下一輪致突變 PCR。

11.如果沒有預期大小的 PCR 產物，則需要分析原因。

選擇我們的致突變PCR試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！