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產(chǎn)品簡介：

尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Urea PAGE)是目前分離 200 nt 以下的小片段 RNA，尤其是 20 nt 左右的microRNA(miRNA)分子的主要方法，但是單獨配制各種溶液十分繁瑣，為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。

產(chǎn)品特點：

1.一站式，含有電泳所需要的所有試劑，即開即用，十分方便，免去了實驗  人員稱取有毒物品。

2.靈活，可以根據(jù)需要配制各種濃度的 Urea-PAGE，以便對長度各異的RNA 進行電泳。

3.電泳后可直接用于 UV 觀察、銀染、膠回收、Northern 雜交等實驗。

4.使用新型上樣緩沖液，可以防止甘油的干擾。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

本產(chǎn)品第一部分為大紙盒包裝，常溫運輸

成份規(guī)格包裝

尿素105 g×2250 mL 本色瓶

丙烯酰胺，電泳級60 g125 mL 棕色瓶

甲叉雙丙烯酰胺，電泳級3 g10 mL 棕色瓶

TBE 電泳液,10×250 mL250 mL 本色瓶

TEMED1.5 mL1.5 mL 白蓋管

過硫酸銨1 g1.5 mL 綠蓋管

固相 RNase 清除劑250 mL250 mL 本色瓶

使用手冊1 份1 份

成份規(guī)格包裝

2×miRNA 尿素

-PAGE 上樣液1.5 mL1.5 mL 紅蓋管

miRNA 電泳分子量

標準（15-50 nt）150 μL1.5 mL 藍蓋管

保存和運輸

miRNA 尿素-PAGE試劑盒常溫運輸和保存，其中 miRNAon、miRNA Marker 需要低溫運輸，-20℃保存，保存期一年。

自備試劑

miRNA 樣品、RNase-free 水。

使用方法：

1.準備工作：用固相 RNase 清除劑清潔工作平臺

直接將固相 RNase 清除劑原液或 10 倍的新鮮稀釋液噴于臺面，5 分鐘后用普通吸水紙擦凈，最后用沾有固相 RNase 清除劑 1000 倍新鮮稀釋液的吸水紙擦凈，晾干。

2.準備工作：用固相 RNase 清除劑清潔玻璃和塑料器皿將器皿浸泡在固相RNase 清除劑的 10 或 100 倍的新鮮稀釋液中，靜置處理 5 分鐘后取出， 再用固相 RNase 清除劑 1000 倍或 10000 倍新鮮稀釋液浸泡二次以上， 倒立晾干后備用。

3.配制 1×TBE 電泳液:將適量的 10×TEB 電泳液用 RNase-free 水稀釋 10 倍，得到 1×TBE 電泳液待用。此溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，否則易長菌。

4.配制 10%過硫酸銨溶液:精確稱取約 100 mg 過硫酸銨到一干凈的 1.5 mL 離心管中，按每 1 mg 過硫酸銨加 10 μL RNase-free 水的比例加入 RNase-free 水，搖晃溶解待用。10%過硫酸銨溶液有效期不要超過一周。

5.估計所需要的凝膠溶液的體積，一般配制一塊 13 cm×15 cm×0.8 mm的膠需要 15 mL 凝膠溶液，配制一塊 36 cm×45 cm×0.8 mm 的膠需要 120 mL 凝膠溶液。

6.配制 40%的丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液：將 3 g 甲叉雙丙烯酰胺全部倒入裝有 60 g 丙烯酰胺干粉的瓶中，加入 130 mL 自備的 RNase-free水，充分搖晃混勻即得 40%的 Acrylamide/Bis（20:1）溶液。

7.根據(jù)所需要的凝膠溶液的體積，在一的干凈的三角瓶中按下表加入各成分

（此處以配制 100 mL Acrylamide/Bis 終濃度為 15%的凝膠為例）:

成份終濃度用量

尿素7 M42 g

40%Acrylamide/Bis 溶液15%37.5 mL

10×TEB 電泳液1×10 mL

補 RNase-free 水到 100 mL

注:Acrylamide/Bis 的終濃度需要根據(jù)待分離 RNA 長度選擇(見下表)。

需分離的 RNA 長度范圍Acrylamide/Bis 終濃度

6-100 nt20 %

25-150 nt15 %

40-200 nt12 %

8.攪拌并加熱到 40-50℃左右，直到尿素完-全溶解。

9.冷卻到室溫后，將三角瓶接上真空系統(tǒng)抽真空處理 10-15 分鐘以充分去除溶液中的氧氣（氧氣會降低聚合反應效率）。若條件有限，此步可省略。

10.邊搖晃溶液變加入 50 μL TEMED 和 500 μL10%過硫酸銨溶液。注意：如果選擇其他工作濃度的 Acrylamide/Bis，此二成分的用量不需要隨之改變。但如果配置的凝膠溶液的體積變化，此二成分的用量要按比例改變。

11.再充分搖晃約 30 秒后迅速灌膠，然后插入樣品梳，室溫放置 30-60 分鐘等待膠凝固。

12.將凝膠板放置在電泳裝置上后，在上下層分別加入適當量的 1×電泳緩沖液。如果不馬上使用，需要有濕紙將上樣孔端蓋住以防凝膠過度干燥。

13.拔出梳子后用加樣槍吸取電泳緩沖液，充分將每個加樣空中未聚合的Acrylamide/Bis、尿素和氣泡吹打出來。

14.在上樣前，預電泳 20-30 分鐘以使多余的過硫酸銨跑出加樣空，同時還可以使凝膠的溫度升高（到 50℃左右），有利于 RNA 變性狀態(tài)。

15.將 5 μL miRNA 樣品與和 5 μL miRNA 電泳分子量標準（15-50 nt）分別和 5 μL 的 2×miRNA 上樣液混合，70℃保溫 2-3 分鐘后迅速放置在冰上冷卻，快速離心半分鐘，放冰上待用?？梢栽黾?miRNA 樣品的用量，但上液需要等比例增加。

16.關(guān)電泳儀后開始上樣。10 μL 混合液需要全部上樣。

17.重開電泳儀，對 13 cm×15 cm 的膠，以 20-30 mA 的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止；對 36 cm×45 cm 的膠，則以 50-60 mA 的電流電泳，直到紅色染料移動到凝膠邊緣為止。

18.染色觀察：將凝膠一面的玻璃板揭開，直接用仍然附著在另一玻璃板上的  凝膠進行各種染色，包括銀染（需單獨購買試劑盒）、EB 染色（每 100 mL 1×TBE 中加 20 μL 10 mg/mL 的 EB 溶液）、克必隆低毒核酸染料染色（每 100 mL 1×TBE 中加 10 μL 低毒核酸染料）。如果用后兩種染色法染色，需要在 UV 下觀察并拍照。本產(chǎn)品提供的 miRNA Marker有 5 條帶，從上到下的長度分別為：50 nt、40 nt、30 nt、20 nt 和 15 nt。

19.其它

后續(xù)處理（本試劑盒不含所需試劑），流程僅僅供參考。

miRNA 回收：在 UV 下確定所需要的 miRNA 條帶的位置，切膠后進行膠回收處理（需要單獨購買試劑盒）。

Northern 雜交：UV 觀察后將凝膠中的RNA 電轉(zhuǎn)移到帶正電的尼龍膜上，然后進行雜交處理。

放射自顯影：如果 miRNA 樣品電泳前經(jīng)過同位素標記，則將凝膠一面的玻璃板揭開，用濾紙將附著在另一玻璃板上的凝膠吸附過來，然后包上保

鮮膜，真空抽干，然后使膠跟 X 光片向?qū)χ眠M行放射自顯影。

選擇我們的miRNA 尿素-PAGE試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！