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產品簡介：

本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA 聚合酶的RNA 體外轉錄及加帽試劑盒，它利用含有 T3 啟動子的模版 DNA，以 NTP 和 m7G(5' )ppp(5' )G 為底物從 T3 啟動子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補的 RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子（含帶帽 RNA）。

產品特點：

1.即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動子的 DNA 模板即可以進行體外轉錄實驗，不需單獨準備每一個成份。

2.體外轉錄和加帽同管一步式進行，不需要先體外轉錄再加帽。

3.單溶液預配液，減少加樣次數，避免了操作誤差，增加了可重復性。

4.模板 DNA 可以是線性化的質粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產物。

5.可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 5000nt 之問。

6.產品配方經過精心優化，每μg DNA 模板可以合成 2-6μg RNA。

7.得到的加帽 RNA 比不加帽的 RNA 更穩定，可以用于 RNA 結構研究、核解生物化學、體外翻譯、RNA-蛋白質相互作用、反義技術、SELEX 技術和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。

產品參數：

成份規格包裝

2×T3 體外轉錄及加帽預配液50μL0.1mL 本蓋管

T3 RNA 聚合酶-RI 混合液5μL10μL 紅蓋管

RNase-free 水1mL1mL 藍蓋管

使用手冊1 份無

保存和運輸

T3體外轉錄及加帽試劑盒低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

如果需要去除轉錄產物中的 DNA 模板，則需要 RNase-free DNase、Tris 飽和

酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇。

使用方法：

一、制備 DNA 模板

PCR 片段和質粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質粒 DNA，則必須先用適當的限制性內切酶切成線狀。二是需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動子。如果模板是 PCR 產物， 則可以在設計引物時將 T3 啟動子序列

（5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆

到載體上，則需要選擇有 T3 啟動子的載體，并且克隆位點必須位于 T3 啟動子下游。三是需要轉錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果

是 3’突出（如選擇了 Pst I 來線性化質粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留 RNase A。

二、體外轉錄及加帽反應

1.如果有 N 個樣品，強烈建議做一個陰性對照，故共設置 N+1 個反應，這樣一起并排電泳時容易判斷哪個條帶是模板 DNA，哪個條帶是擴增得到的RNA。在 N+1 個 RNase-free 的塑料離心管中，在室溫下（不是在 4℃下）按次序加入下列成分：

注：此為 20μL 反應體系的用量，對其他體積的反應體系，各成分的用量可以按比例增減。如果需要標記 RNA 探針，則需要另購 NTP 與 2×T3 轉錄預配液分開提供的試劑盒。

2.37℃保溫 1-2 小時。注意：延長保溫時間并不能提高產量。

3.70℃加熱 10 分鐘滅活 T3 RNA 聚合酶。

4.取 1-3μL 電泳檢測轉錄效果。比陰性對照多出的條帶就是擴增得到的 RNA

（由于檢測時的電泳不需要堿變性膠，并且合成的 RNA 長度不一定均勻， 即使長度均勻，但由于自生形成發夾結構，因此不一定呈現清晰的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此轉錄得到的 RNA 一般比其模板電泳速度更快。

5.定量，可以用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒檢測濃度，也可以肉眼比較電泳膠上 RNA 和 DNA 的強度。由于 RNA 是單鏈，跟核酸染料結合力低，因此同等亮度的 RNA 條帶，其 RNA 分子數一般比 DNA 的分子數多一倍。1 μg DNA 模板一般可以合成 2-6μg 的 RNA（含帶帽 RNA）。

得到的 RNA 可以放-80℃保存（溶液中有 DNA 模板和未使用的 NTP）。注：若需進一步去除 T3 轉錄反應體系中的 DNA 模板，可參考下列操作步

驟，但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。

1.  在體外轉錄結束后，在反應體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。 2. 37℃保溫 15-30 分鐘。

3.補水到 100μL，

4.用自備的等體積（100μL）的 Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的 DNase和 RNA 聚合酶。

5.在上清中加 200μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

6.加入 1mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。

7.短暫離心數秒，用槍頭吸棄上清。

8.晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free水中后立即使用或放-80℃長期保存。

選擇我們的T3體外轉錄及加帽試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！