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產品簡介：

PCR 標記的原理是用帶標記的 dNTP 進行 PCR，最后得到的 PCR 產物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。本產品就是基于上述原理的基礎上開發。

產品特點：

1.一站式，本試劑盒提供經過優化的試劑，不需要用戶自己摸索。

2.一次標記可以得到µg 級的雙鏈 DNA 探針或約 700ng 的單鏈 DNA 探針， 足夠多次雜交實驗用。

3.既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。

4.A 型需自備含標記核苷酸的 dNTP，B 和 C 型分別含生物-素和地高-辛標記的底 物 。 可 用 的 自 備 標 記 底 物 包 括  fluorescein-dUTP 、 hydroxycoµmarin-dUTP、resorµfin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。

5.摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測效果-最-佳。

6.標記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。

7.足夠 10 次 50 µL 體系的常規 PCR（用于制備標記反應的模板和設置對照反應）和 5 次 50 µL 體系的標記反應。

8.PCR法DNA探針標記試劑盒（不含標記底物）只能用于科研。

產品參數：

名稱規格包裝

標記專用 PCR Mix(含酶)500 µL0.5 mL 紅蓋管

dATP，10 mM each50 µL0.5 mL 白蓋管

dTTP，10 mM each50 µL0.5 mL 綠蓋管

dGTP，10 mM each50 µL0.5 mL 黃蓋管

dCTP，10 mM each50 µL0.5 mL 本色蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑

DNA 模板和模板專一性引物，常規 PCR Mix。

使用方法：

一：準備工作

1. 按常規的方法設計 PCR 引物，使 PCR 產物（探針）長度在 400-800bp 之間。過短則地高-辛標記摻入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。

2.為保證成功率，最好先用常規 PCR 產物制備 DNA 片段，再以之為模板進行標記 PCR 反應。不推薦以基因組 DNA 或其他背景復雜的 DNA 為模直接進行 PCR 標記反應。

3.四種 10mM 的 dNTP 是分開提供，用于制備 50µL 非標記 dNTP（2mM each，用于非標記PCR，用于制備標記PCR 的模板。配制方法是四種10mM的dNTP 各加 10µL，再加水 10µL 即可）和 25µL 標記dNTP（2mM each，其中標記核苷酸和對應的非標記核苷酸的比例需要自行優化，假如是 biotin或 DIG 標記的是 dUTP，則其對應的非標記核苷酸是 dTTP，兩者的最佳比例一般為 1：3；如果是 BrdUTP，則兩者的最佳比例為 1：1。配制方法是三種 10mM 的 dNTP 各加 5µL，再加標記核苷酸和其對應的標記核苷酸使其總的終濃度為 2mM，再補水到 25µL 即可）。

二：非標記 PCR 產物的制備

1.設置 50µL 非標記 PCR：2×標記專用 PCR Mix 25 µL，dNTP Mix（2mM each）5µL，自備的探針引物（10pmol/µL）各 1µL，1 µg 基因組 DNA或 1ng 質粒 DNA，補超純水到 50µL。

2.按已經優化的 PCR 參數進行常規 PCR。

3.膠回 PCR 產物并定量，膠回收可以避免殘留引物干擾后續的標記 PCR。

三：標記 PCR 反應

注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，降低雜交效

率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。

成份樣品非標記對照

2×標記專用 PCR Mix25 µL25 µL

含標記核苷酸的 dNTP Mix（自備）5 µL不加

dNTP Mix，2mM不加5 µL

若單鏈標記：加探針引物其一50 pmol50 pmol

若雙鏈標記：加探針引物一和引物二各 50 pmol各 50 pmol

膠純化所得 PCR 產物（單鏈標記可用

100ng 模板）10 ng10 ng

超純水補到 50 µL補到 50 µL

1. 按第 5 步的 PCR 參數進行標記 PCR，但需要進行下列修改：一是循環數增加到 35-55 個循環。由于模板為純化后的 PCR 產物，探針對擴增長度完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網絡結構，效果反而更好），所以可以增加循環數；二是延伸時間增加 15 秒，因為標記 dµTP 參入到 DNA 的速度比常規的 dTTP 慢；三是降低復性溫度 5-7℃，因為標記核苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。

2. 標記探針的定量：取標記反應液和對照反應液 1-5 µL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的 DNA Marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記產物中額外帶有生物-素，地高-辛等、其泳動速度將慢于非標記 PCR 產物（但同位

素標記不能用此法）。下圖是一個典型的雙鏈 PCR 產物電泳結果圖：

選擇我們的PCR法DNA探針標記試劑盒（不含標記底物），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！