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產品簡介：

用體外轉錄方法制備的 RNA 是 RNA 藥物和 RNA 疫苗的重要原料，但研究發現如果在體外轉錄時用 5mCTP（5-methylcytosin-5′-triphosphate, CAS#: 327174-86-7）和 m1?TP（N1-methyl-pseudouridine-5′-triphosphate, CAS#: 1428903-59-6）分別替代 CTP 和 UTP，得到的修飾 RNA 翻譯效果提高40 多倍，免疫性也大為降低。為此本公司在常規 T7 體外轉錄試劑的基礎上，升級開發了本產品。

產品特點：

1.用 5mC-CTP 代替CTP，用 m1??UTP 代替 UTP，并且分開而不是以混合液的方式提供，方便用戶制備單一種修飾或者雙重修飾的 RNA。

2.即開即用，用戶只需提供含 T7 啟動子的 DNA 模板即可。

3.提供體外轉錄專用熒光染料，加入到體系中可以實時監控反應的進行，便于優化條件。實驗結束后不需要浪費寶貴的樣本進行電泳。如果擔心染料對后續實驗有影響，也可以不加。

4.模版 DNA 可以是線性化的質粒 DNA，也可以是 PCR 擴增產物。

5.可以合成的 RNA 的最佳長度在 20nt 到 2000 nt 之間。

6.產品配方經過精心優化，1ug 質粒DNA 模版可以在3 小時內合成大約30 ug

修飾 RNA（具體跟模板 DNA 序列，長度，純度等相關）。

7.得到的 RNA 可以用于 RNA 結構研究、核酶生物化學、體外翻譯、RNA-蛋白質相互作用、反義技術、SELEX 技術和 RNA 干擾（RNAi）等實驗。

8.本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的修飾堿基體外轉錄實驗。

9.實時雙修飾 T7 體外轉錄試劑盒只能用于科研。

產品參數：

成份規格包裝

2×雙修飾 T7 轉錄預配液

（含 5mCTP 和m1?TP）0.5 mL0.5mL 綠蓋管

體外轉錄專用熒光染料50 μL0.5mL 棕色蓋

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液50 μL0.5mL 紅蓋管

RNase-free 水1 mL1.5mL 藍蓋管

使用手冊1 份無

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存、有效期一年。

自備試劑

Tris 飽和酚、氯仿、RNase-free 75%乙醇(均可從本公司另購)。

使用方法：

一、制備 DNA 模板（本試劑盒不含所需試劑，此處信息僅供參考）

PCR 片段和質粒 DNA 都可以用作體外轉錄的模板，但是必須注意以下幾點。

1.一是必須使用線性化的 DNA。如果是質粒 DNA，則必須先用適當的限制性內切酶切成線狀。

2.二是需要轉錄的 DNA 序列的上游必須有 T7 啟動子。如果模板是 PCR 產物， 則可以在設計引物時將 T7 啟動子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是將DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T7 啟動子的載體，并且克隆位點必須位于 T7 啟動子下游。

3.三是需要轉錄的DNA 序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如選擇了Pst I 來線性化質粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修平。

4.四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質粒 DNA 的過程中一般要使用大量的 RNase A，因此質粒 DNA 一般都有嚴重的 RNase A 污染， 所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質粒 DNA。并且加入少量總RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此來判斷純化的 DNA 模板是否有殘留 RNase A。如果有 RNase 污染，則必須反復酚-氯仿抽提去除殘留的 RNase，然后再乙醇沉淀質粒 DNA。

二、體外轉錄反應

5.按下表設置體外轉錄反應：

成分樣品管陰性對照管

DNA 模板50 ng 左右的PCR

片段或 1 ug 左右的線狀質粒

不加

2×雙修飾 T7 轉錄預配液

（含 5mCTP 和m1?TP）10 μL10 μL

體外轉錄專用熒光染料1 μL1 μL

T7 RNA 聚合酶-RI 混合液1 μL1 μL

補 RNase-free 水到20 μL20 μL

注：此為 20 μL 反應體系的用量，對其他反應體系，各成分的用量可以按比例增減。修飾 T7 轉錄預配液已經含有修飾核苷酸。

6.在熒光定量 PCR 上 37℃保溫 4 小時。每分鐘采集一次 SYBR 通道的熒光信號。如果沒有加體外轉錄專用熒光染料，可以不采集熒光信號。不一定要跑慢 4 個小時，可以在熒光信號到達平臺期后停止反應

7.如果沒有加熒光染料，反應結束后需要取 1-3 μL 電泳，此時最好用 DNA 模板做電泳對照。電泳時比陰性對照多出的條帶就是擴增得到的 RNA（由于合成的 RNA 長度不均勻，即使長度均勻，但由于自生形成發夾結構，泳動速度也不一致，所以電泳所得 RNA 條帶一般都不是清晰，而是比較彌散的電泳條帶。但由于 RNA 是單鏈，分子量比同樣長度的 DNA 小一倍，因此 RNA 一般比其雙鏈 DNA 模板電泳速度更快。

8.如需去除 DNA 模板，需要另購線狀 DNA 清除劑。最好不要實用 DNase 法。

9.再用自備的 RNA 純化試劑盒純化修飾 RNA。

10.最后用自備的單鏈 RNA 定量試劑盒測定修飾 RNA 的濃度。

11.將純化的 RNA 放-80℃保存。

選擇我們的實時雙修飾 T7 體外轉錄試劑盒，就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！