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產品簡介：

端粒酶存在于 85-90%的腫瘤組織中，因此通過檢測端粒酶活性就有可能早期診斷大多數腫瘤。目前最-常用的檢測端粒酶活性的方法就是 TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol，端粒重復片段擴增)，它利用端粒酶能在底物 DNA 末端添加不同數量的TTAGGG 序列這一特點，通過PCR 檢測延伸產物而高效檢測端粒酶活性。但是傳統的 TRAP 方法為終點電泳檢測法，靈敏度低，沒法定量，同時還容易產生氣溶膠污染。為克服這些缺點，本公司開發了基于探針法 qPCR 的 TRAP 試劑盒。

產品特點：

1.即開即用，提供從細胞裂解到 qPCR 所有試劑，免去自己優化條件。

2.基于探針法熒光定量 PCR，比電泳法 TRAP 靈敏度高。

3.使用探針，專一性比電泳法 TRAP 高。

4.提供陽性對照，可以進行基于此對照的定量分析。

5.一管式操作，免去氣溶膠污染之憂。

6.既可用于定量，又可用于定性。用于定量時線性范圍至少有 5 個數量級。

7.既可用于培養細胞，也可用于實體組織（包括腫瘤組織）。

8.本產品足夠 50 次 20 μL 體系的 TRAP PCR 檢測。

9.小鼠端粒酶活性檢測試劑盒（探針法TRAP）只能用于科研。

產品參數：

編號規格包裝

TRAP 專用細胞裂解液10 mL10 mL 本色瓶

2×TRAP 專用 qPCR

MasterMix0.5 mL0.5 mL 本色蓋

熒光PCR 模板專用稀釋液1.0 mL1.5 mL 綠色蓋

小鼠TRAP 檢測陽性對照

（1E7 拷貝/μL）50 μL0.5 mL 黃色蓋

小鼠端粒酶底物干粉50 次0.5 mL 白色蓋

小鼠TRAP 引物-探針干粉50 次1.5 mL 棕色管

超純水1 mL1.5 mL 藍色蓋

使用手冊1 份1 份

運輸及保存

低溫運輸，-20℃保存，有效期 24 個月。

自備試劑

BCA 蛋白濃度測定試劑盒，固相 RNase 清除劑。

使用方法：

一：標準曲線樣品的制備

以陽性對照 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。

1.標記 6 個離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.在 1-6 號管中加入 45 μL 熒光PCR 專用模板稀釋液。

3.在 6 號管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的小鼠TRAP 檢測陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩

1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩

1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。二：端粒酶的提取

注意：端粒酶的組成成分中有 RNA，極容易被降解，因此，提取端粒酶應該跟提取

RNA 一樣，盡量在低溫條件下快速操作、最好使用本公司的固相 RNase 清除劑預先清潔試驗臺面等容易有 RNase 污染的地方。

7.對冷凍的實體組織：將 50-100 mg 在-80℃冷凍的組織放裝有液氮的研缽中研磨成粉末，再轉移到預冷的玻璃勻漿器中，加入 200 μL 預冷的TRAP 專用細胞裂解液，溫和手動勻漿 6 次后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次，然后直接進入第 10 步操作。

注意：為保證裂解效果，可在顯微鏡下觀察確保大部分細胞已經裂解。如果組織樣品不足 50-100 mg，可以按比例降低TRAP 專用細胞裂解液用量。在-20℃保存的實體組織放置 2 個月后就失去端粒酶活性，而在-80℃保存的實體組織放置數年還有端粒酶活性。

8.對新鮮的培養細胞和組織：用自備的預冷 PBS 洗滌 1E6 個經過胰-酶處理的細胞或50-100 mg 經過胰-酶處理的新鮮組織，3000 g 4℃離心 5 分鐘，棄上清，細胞沉淀可以直接使用，也可以放-80℃保存后續使用。在細胞或組織沉淀中加入 200 μL 預冷的TRAP 專用細胞裂解液，輕柔吹打 3 次懸浮細胞或組織。對新鮮細胞：渦旋振蕩10 秒后置冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次。對新鮮組織：在冰上用玻璃勻漿器輕柔勻漿后冰浴 30 分鐘，每間隔 5 分鐘渦旋振蕩一次。如果細胞不足 1E6 或50-100 mg，按比例降低 TRAP 專用細胞裂解液用量。

9.14000 g 4℃離心 20 分鐘，收集 160 μL 上清（含端粒酶），留 40 μL 不取。

10.取部分上清液用自備 BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度。

11.測出各樣品的蛋白濃度后，用 TRAP 專用細胞裂解液將各樣品的蛋白濃度調成 3 μg/μL，然后分裝合適的量到離心管中，將實驗所需的數量放冰上待用，其余的放- 80℃長期保存（可存放一年）。此步所得樣本稱為端粒酶待測樣本。

12.對每個樣本，一次實驗需要兩管，一管用于測定端粒酶活性，一管用作該待測樣本的熱滅活陰性對照。制備方式是每個樣本取一管端粒酶待測樣本，95℃處理 10 分鐘滅活端粒酶，放冰上待用。沒有用完的可放-80℃長期保存（可存放一年）供下次使用。

二：探針法TRAP（20 μL 體系）

13.確定端粒酶待測樣本的：為便于比較，每個反應所用的蛋白量總量（或對應的細胞數）必須一樣，否則不好進行樣本間的比較。

14.設置反應。如果有N 個樣品，每個樣品做 1 次重復（一般建議作三個重復，此處為表述方便，假設只做 1 次重復），則需要準備 2N+6 個反應管。多 1 倍是因為每個樣本都需要一個對應的熱滅活陰性對照。另外 1 個用作探針法TRAP 陰性對照，最后 5 個用于標準曲線樣本。按下表設置 20 μL 體系的探針法TRAP：

15.吹打混勻后上機進行端粒延伸和 PCR 擴增，反應參數如下：

過程溫度時間

端粒延伸30℃30 min

預變性95℃5 min

PCR 反應95℃15 sec

（45 個循環）57.5℃15 sec

72℃30 sec（采集 FAM 通道，淬滅基團

為 MGB）

注：若使用 ABI 7500 qPCR 儀，復性溫度 57.5℃需改為 48℃。

三：結果分析

16.實驗的有效性判斷：如果標準曲線樣本管的FAM 信號結果為陰性（無 Ct 值，或者大于或等于 35），則整個實驗無效

不需要分析數據，需要重復實驗或跟廠家聯系。如果探針法 TRAP 陰性對照管的 FAM 信號結果均為陽性（有 Ct 值小于 35），說明環境污染，則整個實驗無效，不需要分析數據，需要跟廠家聯系。如果標準曲線樣本管的 FAM 信號結果為陽性，探針法 TRAP 陰性對照管的結果為陰性，則實驗有效，可以進入下步分析。

17.標準曲線制作：以5 個標準曲線樣本濃度的log 值為橫軸，以陽性對照（FAM 通道） 的 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照的標準曲線為斜線，r2 必須大于 0.95。再以待測端粒樣品的 Ct 值從陽性對照的標準曲線上推算出待測端粒酶所合成的端粒重復序列的拷貝數的 log 值，再有此 log 值推算出新合成的端粒重復序列拷貝數。由于新合成的端粒 DNA 重復序列的拷貝數跟端粒酶的活性相關。因此端粒酶活性大小跟測試的 Ct 呈現反相關，同一次實驗所得的 Ct 值可以用來比較各所測各樣本中端?；钚缘南鄬Υ笮?。

選擇我們的小鼠端粒酶活性檢測試劑盒（探針法TRAP），就是選擇精準、高效、可靠的檢測方案，為您的科研實驗保駕護航！