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一、方案背景

葡萄酒釀造依賴微生物的精準發酵，尤其是蘋果酸 - 乳酸發酵（MLF）對提升葡萄酒口感和穩定性至關重要。乳酸菌作為 MLF 的關鍵參與者，其生長和代謝對環境條件極為敏感，需要穩定的溫度、濕度和二氧化碳濃度。二氧化碳培養箱能夠精準調控這些環境參數，為葡萄酒釀造過程中的微生物培養和發酵提供理想條件，從而保障葡萄酒品質。

二、實驗目的

1.利用二氧化碳培養箱優化葡萄酒乳酸菌的培養條件，提升菌種活性。

2.通過控制培養箱參數，實現高效的蘋果酸 - 乳酸發酵，改善葡萄酒的風味和口感。

3.確定二氧化碳培養箱在葡萄酒釀造流程中的最佳使用方案和關鍵參數。

三、實驗儀器與材料

（一）儀器設備

1. 二氧化碳培養箱：溫度控制精度 ±0.1℃，二氧化碳濃度控制精度 ±1%，可調節濕度，配備可視化監控系統。

2. 電子天平：精度 0.0001g，用于稱量培養基和試劑。

3. 無菌操作臺：提供潔凈的微生物操作環境，避免污染。

4. 恒溫振蕩器：輔助乳酸菌培養過程中的均勻混合和通氣。

5. 分光光度計：測定乳酸菌菌液的吸光度，評估菌體生長情況。

6. pH 計：實時監測發酵液的酸堿度變化。

7. 滅菌鍋：對實驗器材和培養基進行高溫高壓滅菌。

（二）實驗材料

1. 葡萄酒乳酸菌菌種（Oenococcus oeni）

2. MRS 培養基：添加碳酸鈣以中和乳酸菌發酵產生的酸

3. 新鮮葡萄汁：經 0.22μm 濾膜過濾除菌

4. 蘋果酸標準溶液

5. 氫氧化鈉標準溶液（0.1mol/L）

6. 無菌培養瓶、移液槍、槍頭、試管等耗材

7. 75% 乙醇、次氯酸鈉溶液等消毒試劑

四、實驗過程

（一）乳酸菌的活化與擴培

1. 活化：將保存的葡萄酒乳酸菌菌種接種至含有碳酸鈣的 MRS 液體培養基中，置于二氧化碳培養箱內。設定溫度為 25℃，二氧化碳濃度為 5%，濕度 85%，培養 48 小時，觀察菌種復蘇情況。

2. 擴培：取活化后的菌液，按照 1% 的接種量轉接至新的 MRS 液體培養基中，同樣在二氧化碳培養箱內，將溫度調整為 28℃，二氧化碳濃度 6%，繼續培養 24 小時，期間每隔 6 小時取樣，使用分光光度計在 600nm 波長下測定菌液吸光度，監測菌體生長對數期。

（二）蘋果酸 - 乳酸發酵實驗

1. 準備發酵液：將除菌后的新鮮葡萄汁分裝至無菌培養瓶中，每瓶 500mL。

2. 接種：將擴培后的乳酸菌菌液按照 2% 的接種量接入葡萄汁中，輕輕搖勻。

3. 設置培養條件：將接種后的培養瓶放入二氧化碳培養箱，設定溫度為 20℃，二氧化碳濃度 8%，濕度 90%，進行蘋果酸 - 乳酸發酵。

4. 參數監測

1. 乳酸菌活菌數：每天取樣，采用稀釋涂布平板法，在 MRS 固體培養基上進行菌落計數，計算每毫升發酵液中的活菌數量。

2. 蘋果酸含量：使用酸堿滴定法，以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定發酵液中的蘋果酸，根據消耗的氫氧化鈉體積計算蘋果酸含量。

3. pH 值：使用 pH 計實時測定發酵液的 pH 變化，記錄數據。

（三）葡萄酒品質檢測

1. 理化指標檢測

1. 酒精度：采用蒸餾法結合密度測定，計算葡萄酒的酒精度數。

2. 總酸：以酚酞為指示劑，用氫氧化鈉標準溶液滴定，測定葡萄酒中的總酸含量（以酒石酸計）。

3. 揮發酸：通過水蒸氣蒸餾，收集餾出液后用氫氧化鈉標準溶液滴定，測定揮發酸含量（以乙酸計）。

2. 感官評價：發酵結束后，邀請 5 名專業品酒師組成品鑒小組，從色澤、香氣、口感三個維度對葡萄酒進行感官評分。評分標準參考國際葡萄酒品鑒體系，滿分為 100 分。

五、實驗結論

1. 最佳培養參數：二氧化碳培養箱用于葡萄酒乳酸菌培養和蘋果酸 - 乳酸發酵時，最佳參數為溫度 20℃、二氧化碳濃度 8%、濕度 90%。在此條件下，乳酸菌活菌數在發酵第 3 天達到峰值，為 8.2×10? CFU/mL，顯著高于其他參數組合下的菌體數量。

2. 發酵效果提升：蘋果酸 - 乳酸發酵效率顯著提高，發酵周期從常規條件下的 10 - 12 天縮短至 7 天，蘋果酸降解率達到 92%，發酵后葡萄酒 pH 穩定在 3.2 - 3.4 之間，揮發酸含量控制在 0.5g/L 以下，符合優質葡萄酒標準。

3. 品質優化：經二氧化碳培養箱輔助發酵的葡萄酒，酒精度穩定在 12.5% vol 左右，總酸含量為 5.5g/L，酒體酸度平衡。感官評價結果顯示，該葡萄酒色澤清亮，果香與發酵香氣融合良好，口感圓潤飽滿，平均感官評分達到 88 分，較未使用二氧化碳培養箱的對照組提高 15%。

4. 應用價值：二氧化碳培養箱通過精準的環境控制，為葡萄酒釀造提供了標準化、可重復的微生物發酵解決方案，有效提升了葡萄酒的品質和生產效率，適用于葡萄酒釀造企業的規模化生產和工藝優化。

• 二氧化碳培養箱

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